p729(p729 枪结构图)难以置信

2023-11-18Aix XinLe

2020年5月29日，《自然—通讯》在线发表了首个细胞色素P450酶的全长精细三维结构，解答了这一数十年未解的科学难题。

p729(p729 枪结构图)难以置信

作者丨李晨

2020年5月29日，《自然—通讯》在线发表了首个细胞色素P450酶的全长精细三维结构，解答了这一数十年未解的科学难题湖北大学生命科学学院、省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室教授陈纯琪、马立新和郭瑞庭。

合作完成了这项工作他们解析了一种P450酶CYP116B46的晶体结构，并阐明电子在分子内传递的方式这对了解P450的结构及完整机理提供了重要指导，且对P450酶在医药和工业领域的应用具有重要价值

万能生物催化剂细胞色素P450是一种酶蛋白，最早于1955年在老鼠的肝脏细胞中发现，因为其与一氧化碳结合的还原态吸收光谱波长约在450nm而得名该蛋白由血红素（heme）结构域和含有黄素单核苷酸（FMN）的还原酶结构域组成；这两个部分通过包含铁硫簇的铁氧还蛋白域相连。

“细胞色素P450是一个庞大的酶家族，简称为CYP，参与许多天然产物的合成途径与毒物、药物代谢反应”论文通讯作者陈纯琪告诉《中国科学报》，在植物中，P450家族参与一些特殊化合物的合成，如青蒿素和紫杉醇；在人体中，P450家族主要参与解毒过程，如化解可以导致癌症的黄曲霉毒素等。

这是因为P450的催化多能性很高，涉及20余类反应，包括羟化反应、环氧化反应和成环反应等其底物谱极广，可以识别芳香族、聚酮类、萜类、肽类、糖类等类型的底物，拥有“万能生物催化剂”之称它还具有高度区域选择性和立体选择性，能特异性的识别结构位点和方向。

此外，P450酶的底物结合区具有高度可塑性，透过酶工程改造可以改变底物谱，在重要化学品和药物制造方面的应用深具潜力因此，药物活性化与代谢主要都是由CYP这个酶家族所负责的，大约囊括了生物体中此类代谢的75%。

P450系统广泛存在于所有生物甚至病毒中，已发现超过18000种P450系统人体内已经发现超过57种P450系统，大部分是膜蛋白，主要分布在粒线体内膜或内质网上不过，在大肠杆菌中未发现此类酶蛋白的踪影“绝大多数P450酶需要氧化还原酶来提供电子，以活化底物结合区的血红素，进而转化底物。

”陈纯琪说，建立一个P450系统必须寻找同源或者相匹配的氧化还原酶在P450系统的9个家族中，只有2个家族在同一条多肽链上自带氧化还原酶，被称为自给自足的P450酶，这类酶主要来自细菌另外一些P450系统则需要从外界获得匹配的氧化还原酶，这种情况主要发生在动物体内。

“自给自足的P450酶在生物技术应用方面是极具吸引力的生物催化剂因此，自给自足P450酶内部电子如何传递是一个非常有趣且重要的课题”论文通讯作者郭瑞庭告诉《中国科学报》，此前，科学家已经对P450系统中的血红素和FMN等结构域研究比较清楚，但对中间连接部分始终不了解，缺乏全长精细结构。

“在蛋白纯化及培养晶体的过程中，P450酶极易从中间断裂或降解，因而很难获得完整的全长三维立体结构”陈纯琪说获得全长P450精细三维结构目前已知的自给自足P450酶有两类第一类以来源于巨大芽孢杆菌的CYP102A1为代表，由氮端的血红素结构域和碳端的P450还原酶（CPR）组成，电子传递的方向是从碳端向氮端传递。

虽然这类P450酶的全长精细结构仍然缺失，但对于这类P450酶的电子传递机理也有了一些粗略的理论。

图1 第一类自给自足P450酶结构域排列(a) P450BM3结构域分布图；(b) P450BM3部分晶体结构 (PDB ID, 1BVY)，绿色区域为heme结合域，粉色区域为FMN结合域，红色虚线标示FMN与heme之间的直线距离，括号内为长度 (单位，Å); (c)数个CPR晶体结构，黄色为FAD/NADPH结合域，橘色为hinge区域，粉色同样为FMN结合域。

最左边为来源于大鼠的CPR (PDB ID，1AMO)，呈“closed”构型，中间与右边分别为来源于大鼠 (PDB ID, 3ES9)与酵母-人融合的CPR (PDB ID，3FJO)，呈“open”构型。

所有结合在蛋白质中的辅酶以棒状模型表示第二类是CYP116，该研究所涉及的CYP116B46就属于这一类这类P450由氮端的heme结构域和碳端的邻苯二甲酸二加氧酶还原酶类结构域（PDR）组成，PDR包含了FMN-依赖的还原酶结构域与铁氧还蛋白结构域。

图2 第二类自给自足P450酶结构域排列 (a)CYP116结构域分布图；(b)利用PDR作为电子供体的P450heme结合域与铁氧还蛋白复合体结构左与中: P450cam与假单胞氧还蛋白; 右:CYP11A1与皮质铁氧还蛋白。

绿色区域为heme结合域，粉色区域为 [2Fe-2S] 结合域，红色虚线标示 [2Fe-2S] 与heme之间的直线距离，括号内为长度 (单位，Å)，所有结合在蛋白质中的辅酶以棒状模型表示自给自足P450酶的一条多肽链内是如何将电子从碳端传递到氮端的血红素的？由于30多年来长期缺乏全长的蛋白质结构信息，在该项研究之前尚不清楚。

英国曼彻斯特大学化学生物学教授萨宾•L•弗利奇（SabineL. Flitsch）说：“获得全长酶是一项了不起的成就”许多小组，包括她自己的小组，都试图解析这些结构，因为它们作为生物催化剂具有重大的应用潜力。

“可以说晶体制备已经超越科学，几乎成为一门艺术”陈纯琪说，要想获得一个完整的大蛋白晶体结构，其难度可想而知该研究所用的CYP116B46相对稳定，加上郭瑞庭长年从事晶体制备和结构解析工作积累的丰富经验，他们得以利用X射线晶体学对其完整的晶体结构进行解析。

结构分析表明，在这种酶中，FMN足够接近铁硫簇以实现直接电子转移；但血红素离铁硫簇太远，不允许电子直接转移，而是依靠5个“二传手”氨基酸实现传递“我们解析了来源于CYP116B46全长的晶体结构，且建立了清晰的酶结构模型。

”郭瑞庭说，这条连续性的多肽折叠成三个结构域，由两段连接肽相连，从氮端到碳端依序为：血红素结合域、还原酶结构域和铁氧还蛋白结构域

图3 CYP116B46整体结构图(上)三个结构域分别由Linker 1和Linker 2连接，氮端(N)、碳端(C)和结合的配体都分别在图上标出；(下)三个结构域分别对应的氨基酸编号郭瑞庭介绍，结构解析后发现，CYP116B46三个结构域的排列与电子传递的方向竟然非常一致。

血红素结合域的底物结合区朝向外，有利于底物进入结合，这显示结构的排列相当合理其中，还原酶结构域和铁氧还蛋白结构域的直线距离为7.9Å，有利于电子的直接传递“科学家普遍认为，小于8Å的距离是电子可以直接传递过去的。

”郭瑞庭说另一方面，铁氧还蛋白结构域和血红素的直线距离达25.3Å，超过目前认定的有效直接电子传递距离。

图4 CYP116B46分子内电子传递途径(a)粗箭头代表电子传递的方向，虚线箭头代表底物 (substrate) 进入活性口袋的方向，三个氧化还原中心之间的虚线与括号内的数值标示着它们之间的直线距离 (单位, Å)；(b) FMN C8上的甲基到 [2Fe-2S] 的Fe2之间的传递通路由虚线表示，[2Fe-2S] 和heme之间可能涉及电子传递的氨基酸也被标记出来，主链和侧链都可能对输送电子有作用的氨基酸则用星号标记，氨基酸用棒状模型表示，而他们的主链用球形模型标记。

5个“二传手”传递电子“在这两个氧化还原中心之间，由其他辅助因子来帮助电子传送的可能性较低”郭瑞庭解释说，因为结构显示二者之间的通道狭窄，缺乏其他辅助因子结合的特征另一方面，考虑到氨基酸也是一种电子载体，所以二者之间的氨基酸也有可能在电子传送的过程中扮演重要角色。

“现在我们有机会设计还原酶结构域和电子转移途径”陈纯琪说为了分析这些氨基酸的侧链基团对于CYP116B46酶活性的影响，他们将这些位点分别突变成丙氨酸，并进行产物生成量的测定来评估每个氨基酸扮演的角色郭瑞庭介绍，酶活测试结果显示，R388、R718、E723、S726和E729的丙氨酸突变体活性明显下降。

将这些位点再次标定在结构上，可以看出大致的电子传递方向R378A突变体蛋白质缺乏血红素造成的红色，一氧化碳处理后也没有出现吸收峰带移的现象加上R378的所在位置邻近血红素，推测R378可能与结合血红素相关。

因此，R378A的突变造成的效应更加复杂，需要进一步实验才能判断此一位点对于CYP116B46电子传递的影响。