2.2.7 Western blotting 检测海马构造 PI3K/Akt 旌旗灯号通路及凋亡相干卵白表达 取各组小鼠海马构造，参加 RIPA 裂解液（ RIPA ∶ PMSF ∶ 磷酸酶 100 ∶ 1 ∶ 1 ），提取总卵白， BCA 法测定卵白含量

　　2.2.7 Western blotting 检测海马构造 PI3K/Akt 旌旗灯号通路及凋亡相干卵白表达 取各组小鼠海马构造，参加 RIPA 裂解液（ RIPA ∶ PMSF ∶ 磷酸酶 100 ∶ 1 ∶ 1 ），提取总卵白， BCA 法测定卵白含量。卵白样品经 12% 十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳百科全书英文名，转至 PVDF 膜， 5% 脱脂奶粉封锁 1.5 h ，参加一抗， 4 ℃ 留宿孵育； TBST 洗膜后，参加二抗（ 1 ∶ 5000 ）， 37 ℃ 孵育 1.5 h ； TBST 洗膜后，分离 ECL 化学发光法显影，凝胶成像体系收罗图象， Image J 软件停止分度值阐发。

　　所无数据用 SPSS 25.0 软件停止阐发。各组计量材料契合正态散布及方差齐性者以独身分方差阐发，偏态散布的计量材料先用 Kruskal-Wallis 法停止组间整体比力，并以 暗示。

　　来 源：程 芳，张 杰，胡加成，徐 欢，先劲燃，谢兴亮，盛艳梅．基于收集药理学与植物尝试探求木樨醇提物对慢性脑缺血神经毁伤的庇护感化及机制 [J]. 中草药, 2023, 54(16):5233-5243.

　　2.1.4 木樨与慢性脑缺血交集靶点的基因本体（ gene ontology ， GO ）功用及京都基因与基因组百科全书（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes ， KEGG ）通路富集阐发 在线翻开 DAVID 数据库，将中心靶点导入到数据库中，挑选官方基因称号，物种限制为“ Homo sapiens ”，阐发布景挑选为“ Homo sapiens ”，别离停止 GO 富集阐发和 KEGG 通路阐发并收拾整顿所得数据。得到明显富集且与慢性脑缺血相干的通路及生物学历程， P ＜ 0.05 暗示具有统计学意义，按基因数停止排序，挑选出具有明显差别的生物历程和牢靠的靶点通路，在线翻开微生信画图网站绘制柱状图和睦泡图，并将所得的通路构建“身分 - 靶点 - 通路”收集。

　　综上，本研讨初次报导了木樨醇提物抗慢性脑缺血小鼠神经毁伤的庇护感化及能够机制，为木樨用于慢性脑缺血疾病的防治供给科学根据百科常识大全及谜底挑选题，也为响应脑缺血神经庇护药物的研发开拓新思绪。但是其次要药效物资根底及其多路子、多靶点抗脑缺血神经毁伤的深化机制尚待进一步探求。

　　2.1.3 获得木樨与慢性脑缺血交集靶点并构建卵白质 - 卵白质互相感化（ protein-protein interaction ， PPI ） 收集 将木樨和慢性脑缺血的潜伏靶点导入 VENNY2.1 以获得交集靶点。将获得的交集靶点导入 STRING 数据库，挑选交互感化阈值＞ 0.4 ，构建 PPI 收集图。得到 TSV 格局文件，并将其导入 Cytoscape 软件停止收集拓朴阐发。

　　持久脑构造血流量低灌注激发认知功用停滞，且慢性脑缺血而至认知功用停滞的形状学根底是胆碱能神经元功用停滞，次要表示为 ChE 活性降低、ChAC 活性及乙酰胆碱程度低落等[23-24] 。因而，借助相干检测办法评价木樨醇提物改进慢性脑缺血致神经功用停滞等感化是一种主要步伐。右边颈总动脉结扎法因其灭亡率低，可包管脑血流量（cerebral blood flow ，CBF ）连续轻度低落，并呈现契合疾病历程的脑缺血认知功用停滞，现已被普遍 使用于慢性脑缺血的尝试研讨[25-26] 。本研讨接纳右边颈总动脉结扎法复制慢性脑缺血模子，分离举动学评价办法旷场尝试发明，与模子组比力，木樨醇提物组小鼠的站立次数、中心地区活动间隔均较着增长。且活动轨迹图也显现，模子组小鼠探究举动削减，表示较着的趋触性：即沿着边沿活动，空间中心探究活动削减；相较模子组，木樨醇提物可有用改进以上功用停滞。同时，模子组ChAC 活性明显低落，ChE 活性降低，而木樨醇提物给药后能够明显逆转。以上成果提醒，木樨醇提物可有用加强中枢胆碱能体系功用，改进脑缺血小鼠的认知功用停滞。

　　2.2.6 小鼠海马构造 ChAC 和 ChE 含量检测 小鼠处身后，疾速取脑，冰上剥离海马构造，参加预冷的心理盐水，冰浴前提下匀浆处置， 3000 r/min 离心 10 min ，取上清根据试剂盒仿单停止检测。

　　3.2.1 木樨醇提物对慢性脑缺血小鼠神经举动的影响 旷场尝试成果（表 2 ）显现，脑缺血模子小鼠呈现烦闷感情及探究才能削弱等认知功用停滞，表示为站立次数及中心地区活动间隔明显削减（ P ＜ 0.001 ）；与模子组比力，木樨醇提物能较着进步小鼠的站立次数与中心地区活动间隔（ P ＜ 0.01 、 0.001 ），提醒其能有用改进小鼠的烦闷感情。同时旷场活动轨迹 成果（图 3 ）显现，模子小鼠举动具边沿四周举动偏向，而木樨醇提物可进步小鼠向中心地区探究的才能，改进其认知功用。

　　3.2.2 木樨醇提物对慢性脑缺血小鼠海马构造ChE 和ChAC 程度的影响 如表3 所示，与假手术组比力，模子组小鼠海马中ChE 程度明显降低（P ＜0.001 ），ChAC 程度明显低落（P ＜0.001 ）；与模子组比力，木樨醇提物高、低剂量组可经由过程降低ChAC 程度（P ＜0.001 ），低落ChE 程度（P ＜0.001 ），加强中枢胆碱体系功用，改进认知功用停滞。

　　比年来百度百科手机版创立词条进口企业百度百科创立，慢性脑缺血患者的数目大批增长百科全书英文名。差别年齿阶段统计的慢性脑缺血病发率显现百度百科手机版创立词条进口， 80 岁及以上白叟占80% ，60 岁及以上病发率为70% ，45 ～50 岁中也有1/4 的人存在慢性脑缺血病症。因而可知，该病发作率趋势年青化，正视和有用防治慢性脑缺血是当前亟待处理的成绩[17] 。今朝，中药经由过程多靶点、多路子的团体调控医治脑缺血已凸显出明显劣势。木樨富含多种芬芳身分[7] ，味辛，具有发散、行气、活血等感化特性，易经由过程血脑屏蔽、改进脑微轮回等路子抵御脑缺血神经毁伤，但其医治慢性脑缺血的详细份子机制尚不明白，因而本研讨接纳收集药理学探求木樨医治慢性脑缺血的潜伏感化机制并分离植物尝试停止考证，觉得前期研讨供给实际及尝试参考。

　　2.2.3 神经举动评价 给药完毕后，接纳巨细鼠旷场举动尝试体系评价各组小鼠自觉举动及探究举动。旷场箱底部由 40 cm × 40 cm 的滑腻黑板组成，侧壁由高 40 cm 的滑腻黑板组成，配有植物举动学 数据主动收罗和处置体系。数码摄像头置于旷场箱正上方 1 m 处，用于记载小鼠全部旷场箱视野内的活动 影象。旷场尝试参考文献办法 [16] ，将底部 20 cm × 20 cm 的正方形地区分别为中心区，小鼠放入中心区的格子，翻开摄像头开端计时。每只小鼠尝试工夫 5 min 企业百度百科创立，第 1 分钟为顺应工夫，不断止计数企业百度百科创立，第 2 分钟开端计录小鼠在 4 min 内的站立次数及中心地区活动间隔，持续测试 3 d 。

　　3.2.3 木樨醇提物对慢性脑缺血小鼠海马构造病理变革的影响 如图 4 所示，假手术组海马神经元构造完好、布列严密且划定规矩，染色平均。模子组海马神经细胞较多呈现形状非常呈不划定规矩梭形，细胞核 固缩深染。木樨醇提物可差别水平地削减海马神经细胞毁伤，此中高剂量组药效更较着。

　　2.2.2 慢性脑缺血模子复制、分组及给药 接纳右边颈总动脉结扎法建造慢性脑缺血小鼠模子 [13] ，模子复制胜利评判尺度 [14] ： ① 结扎后小鼠右眼变成浅红色，天然清醒后，右眼半闭且色彩改变成微红； ② 激光散斑血流检测小鼠右边脑血流较左边降落 20% ～ 30% ，将造模契合尺度的小鼠归入研讨。小鼠随机分为假手术组、模子组、脑络通（ 195 mg/kg ）组和木樨醇提物低、高剂量（ 125 、 375 mg/kg ）组，每组 10 只。脑络通胶囊给药剂量为 1.5 ～ 3 g/d ，取 1.5 g/d ；木樨取人用生药量 3 、 9 g[15] ， 体质量以 70 kg 计，根据人与小鼠体外表积换算系数获得小鼠木樨低、高剂量组生药量别离 390 、 1170 mg/kg 。并按照提取物得率（即 1 g 木樨相称于 0.32 g 提取物）换算获得小鼠的给药剂量别离为 125 、 375 mg/kg 。各给药组持续 30 d ig 响应药物（ 10 mL/kg ），假手术组和模子组 ig 等体积的心理盐水。

　　2.1.2 获得慢性脑缺血疾病靶点 以“ chronic cerebral ischemia ”为枢纽词，检索疾病数据库（ OMIM 、 GeneCards ）中的疾病靶点，将 2 个数据库成果兼并、去重，所得成果即为慢性脑缺血疾病靶点数据集。

　　2.2.5 TUNEL 染色 察看脑构造神经细胞凋亡状况 脑构造经牢固、包埋、切片后，根据 TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒仿单停止操纵，在 200 倍光镜下，察看大脑皮层神经细胞凋亡状况，统计一般及凋亡神经细胞数目，计较细胞凋亡率。

　　2.2.1 木樨醇提物的制备 木樨醇提物由成都医学院国度中医药办理局中药药剂学二级尝试室制备供给。称取 200 g 木樨，参加 95% 乙醇 2400 mL ，回流提取 3 h ， 200 目滤布滤过，提取液 50 ℃减压稀释至相对密度为 1.05 （ 50 ℃）的清膏，冷冻枯燥得木樨乙醇提取物 64.1 g （即 1 g 提取物相称于 3.12 g 木樨生药），接纳高效液相色谱法测得此中毛蕊花糖苷、红景天苷质量分数别离为 30.03% 、 5.21% 。

　　本公家号已与浙江慧通测评植物尝试中间搭建严密的协作干系：该植物中间已得到植物利用答应并在建植物举动学尝试中间，如您需求含药血清制备-身分阐发、灌胃给药、造模、药理、毒理和相干尝试手艺撑持，欢送联络我们（1278317307）！

　　3.2.4 木樨醇提物对慢性脑缺血小鼠大脑皮层神经元凋亡率的影响 如图 5 和表 4 所示，与假手术组比力，模子组小鼠大脑皮层神经元 TUNEL 阳性细胞数目增加，凋亡率明显降低（ P ＜ 0.001 ）；与模子组比力，木樨醇提物可有用削减脑缺血小鼠脑皮层 TUNEL 阳性细胞数，抑止细胞凋亡（ P ＜ 0.001 ）。

　　3.1.2 木樨的 GO 功用与 KEGG 通路富集阐发 在线翻开 DAVID 数据库，导入 20 个“木樨 - 慢性脑缺 血”配合靶点，别离从生物历程（ biological process ， BP ）、份子功用（ molecular function ， MF ）、细胞构成（ cellular component ， CC ） 3 个方面进 行功用富集阐发百科常识大全及谜底挑选题，按照基因数停止排序，对富集成果排名靠前且 P ＜ 0.05 的条目停止阐发。成果显现，木樨医治慢性脑缺血靶点的生物历程与细胞凋亡历程的负调理、 RNA 聚合酶 II 启动子转录的正向调理、旌旗灯号转导、卵白质磷酸化的正向调理等相干，细胞组分次要富集于细胞质、质膜、胞质、核、核质、膜筏等，份子功用则与卵白质分离、酶分离、卵白激酶活性等亲密相干（图 2-A ）。 KEGG 成果显现共有 131 条旌旗灯号通路被明显富集，包罗癌症通路、 PI3K/Akt 旌旗灯号通路、 EGFR 酪氨酸激酶耐药、 VEGF 旌旗灯号通路、催乳素旌旗灯号通路百科常识大全及谜底挑选题、 Ras 旌旗灯号通路、丝裂原活化卵白激酶（ mitogen-activated protein kinases 百科全书英文名， MAPK ）旌旗灯号通路等（图 2-B ）。将成果可视化构建“身分 - 靶点 - 通路”网 络（图 2-C ）。

　　2.2.4 苏木素 - 伊红（ HE ）染色 察看脑构造病理变革 旷场尝试完毕后，小鼠 ip 10% 水合氯醛后断头后取脑，置 4% 多聚甲醛浸泡 1 周牢固，通例脱水、通明、浸蜡、包埋、切片、 HE 染色百科常识大全及谜底挑选题，光学显微镜下察看脑构造海马区细胞构造变革并拍摄图片。

　　收集药理学成果表白木樨能够经由过程调控 PI3K/Akt 旌旗灯号路子阐扬慢性脑缺血毁伤庇护感化。PI3K/Akt 旌旗灯号通路作为典范的抗凋亡、促存活旌旗灯号转导路子，在保持细胞保存和抑止细胞凋亡中起偏重要的感化[29] 。激活PI3K/Akt 通路，增进Akt 磷酸化，低落凋亡卵白Bax 和cleaved Caspase-3 等的表达，从而抑止细胞凋亡，是增进神经元存活的主要步伐[30-32] 。Western blotting 检测成果表白，与假手术组比力，模子小鼠p-PI3K/PI3K 、p-Akt/Akt 、Bcl-2/Bax 值较着低落，Cyt-C 和cleaved Caspase-3 表达较着增长；与模子组比力，木樨醇提物可较着进步p-PI3K/PI3K 、p-Akt/Akt 、Bcl-2/Bax 值，下调促凋亡卵白Cyt-C 、cleaved Caspase-3 、Bax 等的表达。本研讨成果考证了收集药理学阐发提醒的木樨经由过程调理AKT1 、CASP3 等枢纽靶点阐扬抗慢性脑缺血神经毁伤感化。

　　慢性脑缺血是大脑灌注不敷所惹起的脑功用停滞疾病 [1] 。比年来，慢性脑缺血的抱病率逐年爬升，其激发停顿性的认知、进修、影象才能降落使患者及家眷的性命质量都遭到宏大打击 [2] 。但是，今朝临床医治慢性脑缺血尚缺少幻想药物。慢性脑缺血起病慢、防治工夫长，赶早辨认和干涉能够有用地阻遏疾病的开展，进步患者糊口质量。研讨表白，慢性脑缺血的病理机制非常庞大，包罗神经细胞凋亡、氧化应激、炎性毁伤等 [3] 。持久脑构造血流量低灌注激发神经元灭亡，细胞凋亡即是此中次要的灭亡情势，而脑白质和海马 CA1 区的神经元凋亡又将惹起认知、进修影象功用停滞 [4] 。因而抑止或削减脑缺血后的神经元凋亡，对规复缺血后神经功用相当主要。

　　收集药理学挑选出木樨潜伏感化靶点 289 个，并猜测其可感化于198 个慢性脑缺血疾病靶点百科全书英文名。经由过程对这198 个靶卵白停止PPI 收集阐发，筛得木樨医治慢性脑缺血的枢纽靶点为AKT1 、VEGFA 、CASP3 等。AKT1 作为一种丝氨酸/ 苏氨酸卵白激酶，另有AKT2 和AKT3 2 种亚型，此中AKT1 次要存在于脑、心脏和肺中[18] 。研讨发明，AKT1 可经由过程抗凋亡机制增进急性脑缺血、阿尔茨海默病等神经体系性疾病的神经元存活，阐扬神经元庇护感化[19] 。VEGFA 是一种促血管内皮细胞发展因子。脑缺血发作后百科全书英文名，VEGFA 经由过程增进脑部神经血管构成及重构阐扬神经庇护感化[20-21] 。CASP3 作为介导细胞凋亡发作的启动子，其活化将触发脑缺血神经元凋亡及细胞焦亡的发作[22] 。KEGG 通路富集成果表白木樨医治慢性脑缺血能够与调控癌症通路、PI3K/Akt 旌旗灯号通路、VEGF 旌旗灯号通路等相干，分离PI3K/Akt 旌旗灯号通路富集靶点基因数及中心靶点中AKT1 的主要性，揣测木樨能够次要经由过程调控PI3K/Akt 旌旗灯号通路阐扬抗慢性脑缺血神经毁伤感化百科全书英文名。为进一步考证收集药理学猜测成果，本研讨接纳植物尝试讨论木樨对慢性脑缺血的神经庇护感化及其机制。

　　3.2.5 木樨醇提物对慢性脑缺血小鼠海马构造 PI3K/Akt 旌旗灯号通路及凋亡相干卵白表达的影响 如图 6 所示，与假手术组比力，模子组小鼠海马构造 p-PI3K/PI3K 、 p-Akt/Akt 值明显低落（ P ＜ 0.05 ）， Cyt-C 卵白表达程度较着降低（ P ＜ 0.001 ）；与模子组比力，木樨醇提物高、低剂量组 p-PI3K/PI3K 、 p-Akt/Akt 值明显降低（ P ＜ 0.05 百度百科手机版创立词条进口、 0.01 ），木樨醇提物高剂量组 Cyt-C 卵白表达程度明显低落（ P ＜ 0.01 ）。

　　木樨属药食同源类中药 [5] ，今朝对其资本开辟次要集合在浸膏、精油和食材使用方面，而关于其药用代价还缺少深化讨论 [6] 。传统医学研讨发明，木樨性温，味辛、无毒，富含多种芬芳身分，具芬芳开窍药的特征 [7] 。芬芳开窍药易经由过程血脑屏蔽、改进脑微轮回、减轻脑水肿等路子抵御脑缺血毁伤，已成为医治中枢神经体系疾病的经常使用药物 [5,8] 。已有研讨报导木樨醇提物可有用改进半乳糖惹起的小鼠影象力消退征象，并抑止小鼠大脑中神经胶质纤维酸性卵白（ glial fibrillary acidic protein ， GFAP ）、神经养分因子 -3 （ neurotrophin-3 ， NT-3 ）的发生，从而阐扬神经毁伤的庇护感化 [9] 。 Lee 等 [10] 研讨表白木樨醇提物可经由过程抗氧化感化庇护大鼠皮层神经元免受 6- 羟多巴胺（ 6-hydroxydopamine ， 6-OHDA ）和谷氨酸引诱的神经元毁伤。别的，木樨醇提物中的苯乙 醇苷也能有用抵御氯化钴引诱的 PC12 神经细胞缺氧毁伤 [11] 百度百科手机版创立词条进口百度百科手机版创立词条进口。今朝关于木樨抗缺血毁伤的机制还没有分析，其药用代价的开辟与使用受限。基于以上研讨揣测木樨醇提物或能成为改进慢性脑缺血神经毁伤的潜力药物。 收集药理学是一门从多条理、多角度阐发药物与疾病干系，猜测活性药物靶点、感化机制等成绩的新兴学科 [12] 。本研讨拟借助收集药理学办法探求木樨医治慢性脑缺血的活性身分及感化靶点，并分离植物尝试评价木樨醇提物对慢性脑缺血小鼠神经毁伤的次要庇护机制，为前期木樨相干产物的研发供给实际根据。

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　　持久的脑灌注不敷极易对大脑皮层及海马发生影响百科常识大全及谜底挑选题。研讨发明，因慢性脑缺血引发的认知功用停滞大鼠海马与皮质区的神经元大批丧失、构造构造非常 [27-28] 。HE 染色成果表白，模子小鼠海马区神经细胞构造发作改动，有些以至固缩为梭形和三角形，海马中的神经细胞较假手术组布列稠密、混乱，而木樨醇提物能够修复海马区神经细胞毁伤。TUNEL 染色成果也进一步提醒，木樨醇提物能够明显削减脑缺血小鼠皮层区神经细胞的凋亡，从而阐扬神经庇护感化。

　　2.1.1 获得木樨活性身分及潜伏靶点 经由过程 TCMSP2.3 数据库，挑选以“ Herb name ”和“木樨”为检索词，将木樨活性身分挑选前提设为口服生物利费用（ oral bioavailability ， OB ）≥ 30% 、类药性（ drug-likeness ， DL ）≥ 0.18 ，并将候选生物活性化合物 2D 构造的 SDF 文档导入 SwissTargetPrediction 数据库，以肯定木樨活性身分的靶点。再操纵 BATMAN 数据库，挑选“ Herb or Herb list ”以“ GUI HUA ”为枢纽词，挑选前提设置为 Score cutoff ≥ 20 、 P ＜ 0.05 ，筛得木樨的活性身分及感化靶点。经由过程文献检索弥补已报导且有药理感化的木樨活性身分，进入化源网搜刮获得其英文名，再进入 PubChem 输入其英文名获得相干 SMILES 号。翻开 SwissTargetPrediction 数据库，将 PubChem 获得的 SMILES 号输入，点击猜测便可获得化合物相干靶点。将上述数据库成果汇总、去重，成立木樨活性身分 - 靶点数据集。

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