1实验目的：用生物素标记的DNA探针与样本蛋白结合，经过PAGE胶电泳后结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢；从而判断该DNA

 

1实验目的：用生物素标记的DNA探针与样本蛋白结合，经过PAGE胶电泳后结合了蛋白质的复合物比未结合蛋白质的探针电泳的速度要慢；从而判断该DNA序列是否和蛋白结合2实验材料l 主要试剂试剂名称品牌cat.No。

EMSA试剂盒RuqiRQM021探针擎科——核蛋白抽提试剂盒碧云天P002840％丙烯酰胺ServicebioG2005Ammonium persulfate麦克林A801037甘油生工A100854

TEMED麦克林T6023l 主要仪器及器材仪器名称品牌cat. No上海勤翔化学发光成像系统勤翔6100微型垂直电泳槽上海天能VE-180转移电泳槽上海天能VE-586四维旋转混合仪其林贝尔BE-1100型

数显圆周摇床SCILOGEXSLK-O3000-SPCR 扩增仪bio.radPTC-100紫外交联仪新芝SCIENTZ03-II细胞超声破碎仪上海净信JY92-IIN电泳仪电源上海天能EPS-300高速冷冻离心机

湘仪TGL-16l 探针序列表1 EMSA探针序列探针信息序列B17 probes wild typeGTGGAGGCTTTTACTCCAAGTTTCGCCCCCAAGGCTCAACATGTAAATAG

B17 wild typeGTGGAGGCTTTTACTCCAAGTTTCGCCCCCAAGGCTCAACATGTAAATAGB17 MutantAgaaagcttagtcttggcttcttctgcagggctgctgctaatttcagaaa

3实验方法l蛋白提取1、 取组织样品 0.5g，液氮充分研磨;2、 加入 200 μL 预冷裂解液，2μL PMSF，2μL Protease inhibitor cocktail和 2 μL DTT，4℃旋转裂解 20 分钟；4℃，16,000 g 离心 10 分钟，弃沉淀，上清为提取液；

3、 BCA 试剂盒测定蛋白质浓度；4、 稀释至20ug/ul，液氮速冻后，-80℃暂时保存lDNA-EMSA 结合反应：1、 按如下表配制反应体系：组分终含量阴性对照实验组1实验组2实验组3实验组4实验组5

突 变 型 冷 竞争反应野生型冷竞争反应10×结合反应液1×2ul2ul2ul2ul2ul2ul2ul2ul细胞核提取物——02.5ug5ug10ug15ug20ug20ug20ugPoly(dI:dC)（1 µg /µL)

1 µg1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ul生物素标记的探针（20 fmol/ul)20 fmol1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ul1ul竞争性探针（野生）(4pmol/ul)4pmol

——————————————1ul竞争性探针（突变）(4pmol/ul)4pmol————————————1ul——补充水至：——20202020202020202、 混匀后在 PCR 仪上37℃反应 20 分钟，让冷探针优先反应；

3、 然后加入标记好的探针，混匀，在 PCR 仪上 37℃反应 20 分钟l电泳及电转移1、 加入5 ul Loading buffer（5×），混匀后立即上样；2、 用 0.5×TBE 作为电泳液按照 150V电压预电泳 60 分钟；。

3、 将带正电的尼龙膜放入 0.5×TBE 中平衡 10min待电泳完成后将加有样品的整块胶取下电转转膜缓冲液为预冷的 0.5×TBE，300mA 转印 30分钟；l紫外交联1、于254 nm 紫外灯进行交联 20 分钟；。

l化学发光反应1、 交联好的尼龙膜加入适量封闭液，于摇床上孵育20 分钟（65转/min）；2、 去掉封闭液，加入按1:3000稀释Streptavidin-HRP于摇床上孵育30 分钟（65转/min）；

3、 去掉Streptavidin-HRP，并用10ml的洗涤液漂洗3遍，每遍于摇床上漂洗5min(75转/min);4、 将膜从洗涤液中取出，稍微吸干上面的液体，放入化学发光仪的载物台上，加入ECL工作液完全覆盖尼龙膜，室温静置2-3 分钟;然后进行信号采集。

4实验结果lEMSA结果

lDNA-EMSA 胶的配制：5％的聚丙烯酰胺凝胶（7ml ）试剂体积TBE buffer (5X)0.7ml40%acrylamide/bisacrylamide0.875 ml20% 甘油0.872 mL

10% 过硫酸铵52 µLTEMED3.5ul水4.5ml项目内容

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