葡萄糖是一种通用的生物能源;然而，其在控制蛋白质相互作用中的作用未被认识，其在分化相关的细胞内

 

       葡萄糖是一种通用的生物能源;然而，其在控制蛋白质相互作用中的作用未被认识，其在分化相关的细胞内葡萄糖升高期间的作用也未被认识叠氮-葡萄糖点击化学鉴定了葡萄糖与多种RNA结合蛋白（RBPs）的结合，包括DDX21RNA解旋酶，发现其对表皮分化至关重要。

葡萄糖结合DDX21的ATP结合域，改变蛋白质构象，抑制解旋酶活性，并解离DDX21二聚体分化过程中葡萄糖升高与DDX21从核仁重新定位到核质相关，在核质中DDX21组装成含有RNA剪接因子的更大蛋白质复合物。

DDX21以葡萄糖依赖性方式定位于mRNA内含子中特定的SCUGSDGC基序，并促进关键促分化基因的剪接，包括GRHL3、KLF4、OVOL1和RBPJ这些发现揭示了葡萄糖在调节组织分化所必需的RNA解旋酶的二聚化和功能中的生化作用机制。

    皮肤表皮的复层上皮形成皮肤的外部屏障，保护皮肤免受外部环境的影响1 - 3表皮包含不同的角质形成细胞层，角质形成细胞层来源于粘附于皮肤基底膜的有丝分裂活性基底细胞有丝分裂后正在分化的上基底细胞产生角质层中皮肤屏障形成所必需的蛋白质和脂质。

4该过程中的破坏会导致常见皮肤病5以及由表皮分化所必需的〉85个基因的破坏引起的单基因疾病的表达表皮分化过程中3，500个基因发生变化6;然而，小生物分子信号在这一过程中的作用以及它们可能调节的蛋白质尚未完全表征。

葡萄糖是一种丰富的单糖，是细胞功能的主要能量来源ATP产生途径葡萄糖代谢支持包括酶生物合成、细胞内运输和细胞增殖在内的多种活性最近的一项研究7表明，葡萄糖在几种组织的分化细胞中积累，包括表皮，在表皮中葡萄糖对分化至关重要。

分化相关的葡萄糖蓄积在代谢未增加的情况下发生，并且通过遗传和药理学手段导致的葡萄糖耗竭被不可代谢的葡萄糖类似物挽救，这表明葡萄糖本身作为一种生物分子线索，使分化过程能够进行与此一致，葡萄糖直接结合促分化转录因子干扰素调节因子6（IRF6），并增强分化基因诱导。

7这些观察结果表明，直接葡萄糖结合可能重塑分化所必需的蛋白质功能，并为寻找影响细胞状态转换的其他葡萄糖结合蛋白提供了依据      DDX 21是一种DEAD盒RNA解旋酶，利用ATP水解产生的能量催化结构化RNA的解旋、RNA双链体的分离和RNA-蛋白质复合物的重塑。

8 DDX 21参与许多细胞过程，包括核糖体RNA加工9和RNA聚合酶II（RNA Pol II）介导的转录10 DDX 21，与7SK小核核糖核蛋白颗粒内的7SK RNA结合（snRNP）复合物，被募集到RNA Pol II转录基因的启动子，该基因编码核质中的核糖体蛋白和snoRNA。

9值得注意的是，DDX 21还影响c-Jun 11转录活性，表明在基因表达中的其他潜在作用由于其在核糖体生物合成和一般转录中的重要功能，DDX 21改变与多种疾病密切相关，包括乳腺癌、8、12胃癌、13和黑色素瘤。

14最近的工作还报告了DDX 21调节黑素细胞干细胞分化15然而，尚未描述DDX 21在表皮分化中的功能在这里，我们显示葡萄糖与ATP竞争直接结合DDX 21并抑制DDX 21解旋酶活性DDX 21在表皮组织中的不可或缺的作用被鉴定，其中DDX 21是以解旋酶非依赖性方式正常诱导分化所必需的。

葡萄糖结合削弱了DDX 21二聚化，并使DDX 21从核仁重新定位到核质，在核质中它组装成含有剪接因子的更大的蛋白质复合物表皮分化中葡萄糖升高改变了DDX 21与RNA的关联，将其靶向特定RNA基序处的促分化mRNA内含子，伴随着必需促分化基因剪接的改变，包括必不可少的促分化转录因子，如GRHL 1 -3、KLF 4、OVOL 1和RBPJ，沿着分化调节信号调节因子，如JAG 1和NOTCH 3。

这些数据确定了葡萄糖与DDX 21结合在重塑其相互作用因子并使表皮分化中的重要作用  结果1：葡萄糖与DDX21相互作用最近通过GFP葡萄糖传感器7和纳米级二次离子质谱法（NanoSIMS）发现表皮组织有丝分裂后分化细胞中葡萄糖升高（图S1A），其中证明葡萄糖对表皮分化至关重要，部分是通过与促分化转录因子IRF6.7直接结合，然而，葡萄糖限制不抑制角质形成细胞祖细胞自我更新（图S1B）。

要搜索对于在分化中起作用的其它葡萄糖结合蛋白，进行了两个基于MS的实验第一种方法使用葡萄糖聚合物葡聚糖亲和色谱法纯化葡萄糖结合蛋白，第二种方法使用完整细胞内的点击化学方法7鉴定通过紫外线C（UVC）与叠氮基葡萄糖交联的蛋白（图1A）。

两种方法产生了91种蛋白质的重叠组（表S1）;出乎意料的是，大多数这些是RNA结合蛋白（RBPs）（图S1 C）在RBPs中，DEAD盒RNA解旋酶DDX 21最富集（图1B）RNA解旋酶具有高度保守的结构16，另外31种解旋酶在葡聚糖柱中富集（SAINT = 1，图1C和表S1），这表明解旋酶可能代表了一种以前未被认识到的葡萄糖结合蛋白。

DDX21是表皮组织分化所必需的考虑到最近注意到表皮分化需要葡萄糖升高，我们探索了DDX 21在这一过程中的作用DDX 21影响细胞增殖的重要过程，17包括rRNA加工和RNA Pol II驱动的转录9与此一致，DDX 21耗竭降低了标志性祖细胞基因的表达，并减缓了体外角质形成细胞祖细胞增殖（图S1 D和S1 E）。

令人惊讶的是，DDX 21缺失也损害了体外表皮分化基因的诱导（图S1 F）为了检查DDX 21在3D组织中的功能，在器官型人皮肤组织中进行DDX 21去除6，18 -20 DDX 21缺失在没有增强细胞死亡迹象的情况下降低了增殖和表皮厚度，同时降低了分化基因表达（图1D-1H和S1 G-S1 L）。

这些数据表明DDX 21在表皮分化中起重要作用葡萄糖与DDX21 ATP结合结构域结合根据支持葡萄糖和DDX 21在表皮分化中的重要作用的数据，接下来检查葡萄糖和DDX 21的相互作用微量热泳（MST）和荧光淬灭（FQ）21，22证明了纯化的重组人DDX 21蛋白和葡萄糖之间的结合（图2A、S2 A和S2 B）（MST的Kd = 3.26mM，FQ的Kd = 0.18mM）;手性不同于葡萄糖的葡萄糖立体异构体半乳糖缺乏相当的结合（图S2 C）。

不可代谢的葡萄糖类似物3-O甲基-D-葡萄糖（3 OMG）可挽救葡萄糖限制导致的表皮分化受损，7以与葡萄糖相似的亲和力结合DDX 21（Kd = 3.98 mM，图S2 C）这些数据表明DDX 21也直接结合葡萄糖作为在表皮分化中起作用的不可代谢的葡萄糖类似物。

DDX21与其他RNA解旋酶共有的一个特征是ATP酶活性，其利用ATP水解解旋RNA16加入350 mM葡萄糖（分化角质形成细胞中葡萄糖的生理浓度）7可使DDX21与ATP的结合降低两个数量级，反之亦然（图2A和2B）。

半乳糖未能改变DDX21与ATP的结合（图2B）此外，在存在葡萄糖的情况下，DDX21 ATP酶活性适度降低（图S2D）这些结果表明葡萄糖和ATP竞争结合DDX21接下来研究DDX21蛋白负责葡萄糖结合的区域，从DDX21 ATP结合域开始。

DDX21与ATP类似物AMPPNP结合的晶体结构分析23表明，序列231 - 236（RTGTGK）可能对AMPPNP结合很重要（图S2E）MST分析表明，AMPPNP以与ATP相当的亲和力结合DDX21（图S2F），与共享的潜在结合位点一致。

既往报告表明，DDX21 ATP结合位点内的K236对ATP酶活性很重要12因此，K236被电荷保守的精氨酸（K236R）或甘氨酸（K236G）取代（图S2G）与野生型（WT）DDX21不同，DDX21K236R和DDX21K236G均未显示ATP酶活性（图S2D），但DDX21K236R仍结合葡萄糖，而DDX21K236G不结合（图2C）。

正如预期，两种突变体均表现出ATP亲和力降低（图2D）DDX21K236R与葡萄糖的结合亲和力不受ATP干扰，因为其不再与ATP具有亲和力（图S2H）与葡萄糖与ATP结合结构域的结合一致，葡萄糖降低了DDX21的RNA解旋活性，而半乳糖未降低（图2E）。

这些数据表明，DDX21与葡萄糖的结合需要其ATP结合结构域内的序列，并在该结构域内建立了区分葡萄糖和ATP结合的特异性点突变体然后进一步定位DDX21上的葡萄糖结合位点首先，用葡萄糖和DDX21进行分子对接24，25。

所有前五种结构都将葡萄糖置于DDX21的ATP结合域，最佳预测结合自由能为7.3 kcal/mol（图2F），认为该水平指示"有效"结合事件26其次，重组DDX21蛋白的UVC交联-MS（图S2I）发现了单个肽ELANQVSK，其在缬氨酸276（V276）处与葡萄糖交联，并具有清晰的选择离子色谱（SIC）、MS和MS/MS（图2G、2H和S2J）。

V276的位置位于DDX21 ATP结合结构域内（图2F）肽APQVLVLAPTR（位于靶肽的N末端侧）用作未发现葡萄糖交联肽的代表性阴性对照品（图S2K）进一步将V276突变为具有庞大侧链的氨基酸色氨酸（W），以占据结合结构域并在空间上阻断相互作用，大大降低了DDX21对葡萄糖和ATP的亲和力（图2I、S2L和S2M）。

这些数据表明葡萄糖与DDX21 ATP结合域相关为探索葡萄糖的存在是否与DDX21的构象变化相关，进行了交联MS（CLMS）（图S2N）CLMS发现了一致的交联位点，在ATP结合状态下鉴定了更多的交联位点，葡萄糖结合诱导了显著不同的交联模式（图2J和2K）。

总之，这些结果证明葡萄糖与DDX21的ATP结合结构域结合并改变DDX21蛋白构象

葡萄糖抑制DDX21二聚化进一步探索了葡萄糖对DDX21构象的影响，特别是其二聚化DDX21二聚化对其解旋酶活性至关重要，并取决于其疏水性LAAALA序列27为了产生专性DDX21单体，将DDX21的LAAALA氨基酸611 - 616突变为RRRRRRR（称为DDX21611R）;还产生了LAAALA缺失构建体（称为DDX21611Del）（图S3A）。

野生型DDX21蛋白质（Kd = 13.8 nM）发生了强二聚化，其被葡萄糖和3OMG降低〉5倍，但不被半乳糖降低（图3A、S3A和S3B）解旋酶死亡的DDX21K236R二聚化与WT相当，并且也被葡萄糖抑制（图3B和S3C）;如预期的，DDX21611R二聚化结构域突变体的二聚化显著降低（图3B）。

免疫共沉淀和蓝色天然凝胶进一步表明葡萄糖抑制DDX21二聚化（图3C和S3D-S3I）在活角质形成细胞祖细胞中，DDX21二聚化较强通过近感连接分析（PLA）测量的信号主要在核仁中观察到;在分化过程中，随着细胞葡萄糖浓度的增加，观察到更少的二聚体（图3D和S3 J）。

二聚化缺陷型DDX 21611 R对ATP和葡萄糖的亲和力与WT DDX 21相似（图3E和S3 K），表明二聚化对于DDX 21结合ATP或葡萄糖不是必需的与WT DDX 21一样，葡萄糖结合也抑制DDX 21611 R的ATP结合（图3E）。

DDX21单体定位于核质DDX21主要位于核仁中28;然而，单体DDX21的定位未知免疫荧光显示WT DDX21存在核仁定位，而DDX21611R专性单体主要位于核质中（图3F、3G和S3L）观察到的葡萄糖对DDX21二聚体的破坏增加了葡萄糖诱导的DDX21单体也可能促进DDX21从核仁到核质的再分布的可能性。

因此，在表皮祖细胞分化期间发生的细胞内葡萄糖生理性增加的背景下，检查WT DDX21的这种可能的再定位7细胞内葡萄糖水平低的表皮祖细胞主要展示核仁DDX21相反，将细胞内葡萄糖水平升高至350 mM的分化细胞显示核质DDX21的量增加，这可通过葡萄糖限制来阻断（图3H-3K）。

值得注意的是，不结合葡萄糖的DDX21K236G突变体的定位不受分化期间葡萄糖升高的调节（图S3M和S3N）在皮肤组织类器官中也观察到DDX21的再定位（图S3O）这些数据与葡萄糖促进单体化背景下DDX21从核仁重新定位至核质的模型一致。

根据DDX21定位于核质及其与RNA Pol II的协调，9检测葡萄糖对DDX21基因组缔合的影响CUT&RUN29发现基因启动子（例如，USP5和CEP290）富集DDX21结合，如报告所述9，但不受葡萄糖显著调节（图S3P和表S2）。

同时，与染色质共纯化的DDX21比例不受葡萄糖影响（图S3Q），这与葡萄糖在调节DDX21与基因组相关性中的主要作用相反DDX21支持的分化不依赖于ATP酶，需要葡萄糖结合由于DDX21主要是细胞核，接下来探索葡萄糖和ATP的亚细胞水平作为分化的函数。

NanoSIMS能够对细胞的元素和同位素组成进行纳米级分辨率测量，与同位素标记的葡萄糖和ATP一起使用在祖细胞的核中检测到高丰度的ATP，而分化的细胞显示较低丰度的可检测ATP（图4A、4B和S4A）.葡萄糖显示相反的模式：在未分化细胞中较低，在分化细胞的细胞核和细胞质区室中均升高（图4A、4B和S4A），与组织类器官中基底上层的升高一致（图S1A）。

这些发现与观察到的在分化过程中葡萄糖取代ATP与DDX21的结合以及ATP结合对于DDX21在分化中的功能可能不是必需的一致值得注意的是，当在祖细胞中过表达WT DDX21和DDX21K236R时，ATP结合缺陷、解旋酶死亡突变体DDX21K236R驱动分化（图S4B），表明分化不需要DDX21 ATP酶活性。

为了进一步探索DDX21的ATP酶活性和葡萄糖结合在表皮分化中的功能，在培养的细胞和组织器官中进行拯救实验（图S4C）在培养的细胞中，解旋酶死亡突变体DDX21K236R有效地拯救了由DDX21敲除诱导的受损分化，而WT DDX21和二聚化突变体DDX21611R表现出部分拯救;葡萄糖结合缺陷型DDX21V276W未挽救（图S4D）。

在皮肤组织器官中，解旋酶死亡突变体DDX21K236R和二聚化突变体DDX21611R也拯救分化，WT DDX21部分拯救，而葡萄糖结合DDX21突变体未能拯救（图4C和4D）这些结果支持葡萄糖结合而非ATP酶活性对于DDX21启动的分化至关重要的模型。

有趣的是，只有WT DDX21，而不是解旋酶死亡或二聚化突变体，拯救了组织器官样的祖细胞中增殖标记Ki67的表达（图S4E和S4F），表明DDX21的ATP酶活性对于维持祖细胞增殖是必需的通过基因编辑在内源性DDX 21基因座引入特异性点突变来概括这些观察结果。

腺相关病毒（AAV）/CRISPR-Cas9同源定向重组（HDR）实现了75%-98%的编辑正常人角质形成细胞大量群体中的天然DDX21等位基因（图S4G）在重建的皮肤类器官组织中，通过引入K236R取代消除DDX21解旋酶活性未能损害表皮分化，二聚化突变611R也是如此。

相反，K236G葡萄糖结合缺陷型DDX21突变消除了分化（图4E）该原位基因编辑数据进一步支持DDX21启动的分化需要葡萄糖结合但不需要解旋酶活性或二聚化的模型

葡萄糖升高与较大蛋白复合物中的DDX21组装相关葡萄糖结合是DDX21分化功能所必需的，可能部分是通过将蛋白质从核仁重新分配到核质，这可能改变DDX21的蛋白质相互作用快速蛋白质液相色谱（FPLC）分级30在一系列分子量级分中检测到DDX21，这可能与其存在于多种蛋白质-蛋白质背景中的前提一致（图5A、S5A和S5B）。

用350 mM葡萄糖孵育蛋白质级分使DDX21转变为更大的蛋白质复合物（图5A、5B和S5B-S5D）HNRNPC的免疫印迹证实，葡萄糖不会引起RBP分布的总体偏移，并且运行之间的洗脱体积保持稳定（图S5E）。

这些结果表明葡萄糖能够使DDX21掺入到较大的蛋白质装配体中葡萄糖增加DDX21接近RNA剪接因子为了鉴定其与DDX 21的邻近受葡萄糖调节的蛋白质，应用了近端蛋白质组学（BioID）31DDX 21与枯草芽孢杆菌生物素连接酶（BASU）32融合，并在原代人表皮角质形成细胞中表达（图S5 F和S5 G）。

研究了三种细胞条件，每种条件均支持健康细胞活力7：（1）未分化的角质形成细胞祖细胞，其含有较低水平（135 mM）的细胞内葡萄糖;（2）在正常葡萄糖培养基（4.5g/L，25 mM）中生长的通过汇合和升高的钙分化的角质形成细胞;这些细胞将它们的胞内葡萄糖水平提高到350 mM;和（3）在葡萄糖限制培养基（0.5g/L，2.8mM）中分化的角质形成细胞，其显示与祖细胞相似的细胞内葡萄糖浓度。

确定的BioID分析每种条件下的300个DDX 21近端蛋白（图5C、S5 H和表S3），通过免疫印迹法验证选定的相互作用子（图S5 G）143 DDX 21-近端在所有三种条件下均检测到蛋白质;然而，其余的在不同条件下不同，表明葡萄糖改变了邻近DDX21的蛋白质谱。

在正常葡萄糖培养基中生长的分化细胞中鉴定的67种DDX21近端蛋白富集了与核小体、剪接体和自溶酶体相关的基因本体（GO）术语（图5D和S5I）.相反，在生长于低葡萄糖培养基中的祖细胞和分化细胞中富集的194种蛋白与核仁和核糖体的术语相关（图5D和S5J）.已知的DDX21相互作用子（如DDX50和NOP56）在两种条件下均得到富集，有助于验证数据集（图5E）。

葡萄糖限制条件下，特异性核仁蛋白（如NOLC1和PPAN）富集程度更高，而多种RNA剪接因子在提供正常葡萄糖的细胞中显示出更高的富集程度（图5E和S5K）DDX21和剪接因子之间的相互作用（例如，HNRNPUL1和HNRNPA2B1）在维持在正常葡萄糖中的分化角质形成细胞中的表达得到PLA证实（图S5L）。

与此一致，生物过程术语的GO分析表明，rRNA加工在低葡萄糖中更丰富，而mRNA剪接在正常葡萄糖中更丰富（图5F和5G）有趣的是，HEK293T细胞中DDX21K236R近端蛋白的GO分析显示，与WT DDX21蛋白相比，剪接因子的富集程度更高（图S5M和S5N），表明DDX21与剪接因子的相互作用不依赖于解旋酶活性。

HA标记的DDX21的免疫沉淀导致HNRNPUL1（BioID数据中检测到的靶标）强烈富集，在正常葡萄糖中培养的分化细胞中富集程度更高（图5H和5I）此外，在正常葡萄糖培养的分化细胞中，DDX21转移至较大分子量洗脱组分中（图5J、S5O和S5P），这与其可能掺入mRNA前体加工复合物一致。

这些数据表明葡萄糖促进DDX21接近参与mRNA加工的蛋白质

葡萄糖增强DDX21与mRNA内含子的结合接下来检查葡萄糖对DDX 21 RNA相互作用的影响RNA交联后进行免疫沉淀（CLIP，特别是easyCLIP-seq）33证明，在维持于正常或低葡萄糖中的分化细胞中，DDX 21与RNA的交联速率相似，表明葡萄糖水平不会全面改变DDX 21与RNA结合的分数（图S6A和S6B）。

出乎意料的是，CLIP-seq数据鉴定出特异性SCUGSDGC RNA基序在整个转录组的DDX21结合位点高度富集（图6A），另一项前mRNA分析鉴定出了一个GGT重复基序（图S6C）在体外，重组DDX21蛋白结合与CLIP-seq DDX21结合基序匹配的RNA的亲和力是G-四链体RNA（G4 RNA，图6B）的7倍，G-四链体RNA是目前已知的最佳DDX21结合RNA，34表明CLIP-seq识别的基序可能代表天然DDX21结合序列，CLIP景观至少部分由DDX21自身RNA特异性驱动。

未检测到与随机序列RNA的结合（图6B）葡萄糖未显著改变DDX21与CLIP-seq鉴定的RNA基序和G4 RNA的体外结合（图6B和S6D），表明葡萄糖并未全面控制DDX21与RNA结合的能力CLIP-seq数据的分析表明DDX21从前rRNA迁移到mRNA的顺序为：（1）角质形成细胞祖细胞;（2）维持在低葡萄糖中的分化细胞;和（3）培养在正常葡萄糖中的分化细胞（图6C和S6E）。

更重要的是，与祖细胞或低葡萄糖细胞相比，DDX21在维持在正常葡萄糖中的分化角质形成细胞中与RNA内含子的结合更多（图6D、S6F和表S4）JUP和GRHL3 RNA是例子：在分化的角质形成细胞中，DDX21与JUP和GRHL3内含子的交联在正常葡萄糖浓度下更多，外显子结合差异很小（图6E）。

此外，随着细胞葡萄糖浓度增加，DDX21结合从U3 snoRNA（rRNA加工）迁移至U1 snRNA（RNA剪接）（图6F）综上所述，这些结果支持一种模型，其中DDX21在与升高的葡萄糖分化时降低其在rRNA加工中的作用，以在前mRNA加工中作为序列特异性因子发挥潜在作用。

HEK293T细胞中生成的CLIP-seq数据补充了这些发现他们发现与WT DDX21相比，解旋酶死亡突变体DDX21K236R以及二聚化结构域突变体DDX21611R的mRNA结合增加，前rRNA结合减少（图6G和表S4）。

与前rRNA的结合减少与葡萄糖结合和DDX21二聚体解离诱导核仁排斥的观察结果一致（图3F-3H）对于解旋酶死亡和二聚化DDX21突变体，观察到与剪接U1/U2/U6 snRNAs的结合增加（图6H和S6G;表S4）。

总之，这些结果表明葡萄糖解离DDX21二聚体，并将DDX21重新组装成参与mRNA前体加工的复合物

DDX21调控表皮分化相关基因mRNA剪接为了探索DDX21在角质形成细胞分化过程中葡萄糖调节mRNA剪接的可能作用，对外显子包含和内含子保留进行了mRNA剪接分析35（表S5和表S6）两项分析均显示，在维持于低葡萄糖或正常葡萄糖中的角质形成细胞从祖细胞分化为分化细胞的过程中，差异剪接mRNA存在显著重叠（图S7A）。

分化细胞中正常和低葡萄糖之间的mRNA剪接差异与相同队列中CLIP-seq识别的DDX21 RNA结合差异的比较也识别出显著重叠（图S7B）更重要的是，高浓度葡萄糖上调的外显子在DDX21与细胞膜的结合上显示出显著差异。

1个内含子与± 2个内含子相比（图7A）与葡萄糖限制相比，在正常葡萄糖中表达较高的外显子上游的内含子显著增加了DDX21与正常葡萄糖的结合（图7B），表明葡萄糖可能使DDX21与特异性mRNA内含子结合，以促进mRNA剪接。

接下来检查分化细胞中DDX21缺失引起的mRNA剪接变化通过基于事件的可变剪接定量36确定，DDX21缺失引起的最常见剪接改变为外显子跳跃，其也被WT DDX21和DDX21K236R拯救（图7C、S7C和表S7）。

DDX21缺失后跳过的外显子显示，与± 2个内含子相比，± 1个内含子上的DDX21结合存在显著差异（图7A）更引人注目的是，与低葡萄糖相比，在正常葡萄糖条件下，DDX21丢失后跳过的外显子± 1个内含子的DDX21结合显著增加（图7B），进一步支持葡萄糖在DDX21依赖性剪接中的作用。

此外，DDX21 RNA结合基序（SCUGSDGC）在外显子中富集，在分化细胞中与祖细胞相比外显子包含增加（外显子跳跃减少）;这在正常葡萄糖与低葡萄糖中培养的分化细胞中也观察到（图7D）SCUGSDGC DDX21基序尤其富集在这些差异性跳过的外显子区域中，甚至控制GC偏倚（图S7D）。

这些结果表明，分化过程中的RNA剪接至少部分通过DDX21的直接、葡萄糖依赖性结合由DDX21调节细胞外基质蛋白1（ECM1）--一种分化标志物--具有两种剪接异构体，一种是基底角朊细胞中的长异构体（ECM1a），另一种是仅在基底上角朊细胞和扁桃体中发现的短异构体（ECM1b），由外显子7产生长同种型的跳跃37 ECM 1与角质形成细胞内环境稳定有关38，其突变引起皮肤病39。

DDX 21缺失导致ECM 1 mRNA中外显子7的分化相关跳跃减少，这被WTDDX 21和DDX 21 K236 R拯救（图7 E和S7E）DDX 21以葡萄糖依赖性方式与ECM 1转录本中外显子7周围区域强烈结合（图7 F），表明DDX 21在促进ECM 1 mRNA中外显子7排除方面发挥作用，并与其在该过程中的葡萄糖依赖性和解旋酶非依赖性作用一致。

进一步评估了DDX 21缺失时外显子包含和内含子保留的mRNA剪接扰动外显子包含和内含子保留变化与CLIP-seq中显示葡萄糖依赖性DDX 21结合的RNA具有显著重叠（图S7 F）在分化程度更高的细胞中观察到内含子保留减少（图S7 G），这表明在角质形成细胞分化中mRNA剪接增强或mRNA年龄增加。

102个基因转录本显示葡萄糖依赖性DDX 21相关，其加工也受DDX 21调节（图S7 F）这些基因富集了与皮肤发育相关的GO术语（图S7 H），包括正常表皮分化和功能所必需的各种基因，包括GRHL 1 -3、KLF 4、OVOL 1、RBPJ、JAG 1和NOTCH 3。

在这些转录本中，DDX 21 K236 R解旋酶失活突变体和WT DDX 21均拯救了差异外显子使用（图7 G、S7 C和表S7），进一步表明DDX 21调节mRNA剪接不依赖于其解旋酶活性例如，DDX 21 K236 R有效地拯救了GRHL 1和GRHL 3中的内含子保留（图7 H），表皮分化所必需的转录因子。

40 -42同时，在保留的内含子附近观察到分化细胞中正常和低葡萄糖条件下GRHL 1和GRHL 3 CLIP峰的强烈分离（图S7 I），支持葡萄糖在促分化因子GRHL 1和GRHL 3的DDX 21依赖性mRNA剪接中的作用。

这样的内含子保留事件可以影响分化：GRHL 3的过表达极大地诱导分化，而过表达内含子13-保留的GRHL 3-在DDX 21缺失时保留增加的内含子（图7 H和表S7）-不诱导分化（图7I）这些结果确定了DDX 21在调节分化促进mRNA剪接中的作用。

讨论：在这里，我们显示葡萄糖直接结合多种RBPs，并特异性控制DDX21的定位和功能DEAD盒RNA解旋酶在哺乳动物组织分化中对DDX21起重要作用在这种情况下，葡萄糖升高作为分化诱导的线索来控制DDX21的作用。

DDX21被发现以解旋酶非依赖性方式对表皮组织分化是必需的，并且直接葡萄糖结合与ATP竞争，诱导DDX21蛋白的构象变化，并解离其二聚体DDX21单体从核仁重新定位到核质，在那里它们与RNA剪接因子组装成更大分子量的复合物。

在分化过程中，以葡萄糖依赖性方式，DDX21与核仁RNA的结合减少，同时与差异性跳过mRNA外显子连接处富集的RNA基序的结合增加最后，DDX21影响关键促分化基因的剪接，而不依赖于其解旋酶活性本文涉及mRNA剪接中DDX21的发现得到了最近关于SMN2.43的工作的支持。

总之，这些数据揭示了葡萄糖作为生物分子线索在表皮分化中调节DDX21的作用机制在表皮分化过程中，观察到翻译的普遍减少，这将减少能量和营养消耗，44表明细胞葡萄糖浓度增加在分化过程中的非能量作用先前的工作支持葡萄糖在组织内稳态中的作用不同于其能量作用。

例如，葡萄糖浓度升高会减缓体细胞增殖并抑制DNA和蛋白质合成45在皮肤中，长期暴露于葡萄糖浓度升高的环境中会缩短人表皮角质形成细胞的复制寿命，45而葡萄糖会在人表皮组织的分化细胞中积累7临床上，糖尿病的特征是组织葡萄糖水平升高，与不良的表皮再生和伤口愈合有关，尽管体内组织葡萄糖升高和血管供应的相对作用还有待解剖。

另一方面，葡萄糖在表皮分化中的基本功能刚刚被鉴定，其中葡萄糖作为蛋白质功能的分子调节剂，7支持葡萄糖在组织内稳态中的作用在这方面，代谢稳定的葡萄糖类似物很容易挽救葡萄糖限制，并对其产生类似的影响，使葡萄糖本身游离。

7二聚化调节是一种经常观察到的生物机制，用于控制从转录因子到信号蛋白再到酶等各种蛋白质的功能46具体而言，据报道，限制性核糖核酸双聚化可增加RNA结合亲和力47和酶活性27另一方面，去二聚化的限制性商业惯例可能具有不同的功能和位置。

例如，多聚嘧啶区结合蛋白（PTB）在细胞核中是二聚体，在细胞质中是单体，细胞质PTB单体与核糖体结合以增强p53的翻译48在这方面，本文鉴定的91种葡萄糖结合蛋白中的29种是RBPs，DDX 21、SF 3A 1、G3 BP 1、IGF 2BP 3和CCT 5在最佳命中中，这增加了葡萄糖作为RBP功能的广泛作用调节剂的可能性。

本研究增加了DDX 21二聚体在rRNA加工中的已知功能9，以突出DDX 21单体在结合前mRNA以调节核质mRNA加工中的葡萄糖激活作用此处的CLIP-seq数据确定了DDX 21在体内和体外与特异性RNA基序SCUGSDGC结合。

含SCUGSDGC的RNA对DDX 21的亲和力高于标准DDX 21 G4 RNA序列已经证明剪接因子依赖性富含GC的外显子更依赖于U1 snRNP相关蛋白，49我们观察到葡萄糖依赖性DDX 21与U1 snRNA结合，提示DDX 21对富含GC的RNA剪接的调节可能与U1 snRNA相关。

另一方面，DDX 21与mRNA的结合不依赖于其解旋酶活性，并且DDX 21在mRNA前体加工中的功能涉及非解旋酶机制DDX 21在这种情况下的作用机制需要进一步分析除了本文研究的分化过程外，葡萄糖50，51和DDX 218，13，14在致癌作用中发挥作用。

确定在特定疾病背景（如癌症）中观察到的组织葡萄糖水平失调是否会在组织稳态背景之外影响DDX 21功能将是令人感兴趣的

文章2：髓系I型干扰素对心肌梗死的反应始于骨髓，并受Nrf2活化的巨噬细胞的调节

组织损伤被认为是通过损伤相关分子模式（DAMP）局部激活先天免疫应答先天性免疫途径是否被远程激活仍然相对未被探索在此，通过分析小鼠和人类心肌梗死（MI）后稳态时约145，000个单细胞转录组，我们发现I型干扰素（IFN）应答（以干扰素刺激基因（ISGs）表达为特征）开始于远离损伤部位的骨髓内中性粒细胞和单核细胞祖细胞中。

在患者的外周血中，我们观察到表达ISG的中性粒细胞和单核细胞的特定亚群在小鼠的骨髓和血液中，在中性粒细胞和单核细胞及其祖细胞中检测到ISG表达;在稳态和MI后随着成熟而增强;并受Tet2和Irf3转录调节因子的调控。

在梗死心脏中，ISG表达细胞受到Ccr2 −稳态心脏巨噬细胞中Nrf2激活的负调控我们的成果显示IFN信号传导开始于骨髓，涉及多种转录调节因子（Tet2、Irf3、Nrf2）调控ISG表达，并为研究患者中的IFN信号传导提供了临床生物标志物（ISG评分）。

背景：缺血性组织损伤是全球最常见死亡原因的初始事件（1）在心脏中，急性缺血导致心肌梗死（MI），这在骨髓中引起远端紧急骨髓生成反应，迅速增加中性粒细胞和单核细胞的产生，并导致外周血白细胞增多、组织浸润和器官功能障碍（例如心力衰竭），这是急性炎症的标志（2-7）。

作为对缺血性损伤的反应，髓样细胞以中性粒细胞和单核细胞重叠波的形式浸润心脏中性粒细胞在心肌梗死后1-2天达到峰值，产生活性氧，形成含蛋白酶和髓过氧化物酶的颗粒，并被认为加剧了组织损伤（8）虽然也提出了保护性中性粒细胞亚群，但梗死中性粒细胞的全部功能多样性仍在很大程度上未被探索（9，10）。

单核细胞在心肌梗死后第3-4天达到峰值，浸润并分化为功能异质性Ccr 2+巨噬细胞亚群，具有促炎和修复表型（2，8，11，12）梗死灶内还存在Ccr 2 −稳态巨噬细胞，其可能通过尚不完全了解的机制发挥保护作用（13-15）。

广义上讲，髓样细胞被认为是在损伤组织微环境中与损伤相关分子模式（DAMP）、细胞因子和其他刺激物相互作用的结果，从而在局部发展其特异性效应器功能（16，17）在此，我们研究了在浸润梗死心脏之前，先天性免疫途径被远程激活的可能性。

I型IFN应答是一种先天免疫途径，最为人所知的是其在抗病毒应答中的作用及其与自身炎性疾病如狼疮的相关性（18-20）我们和其他人最近发现，病理性I型IFN应答也发生在心脏缺血性损伤后（21，22）我们发现基因或药理学抑制IFN信号传导可减少炎症，限制不良心室重塑，并提高小鼠存活率（21，22）。

间接证据表明梗死心脏内对单核细胞源性巨噬细胞有反应;然而，由于与对最近梗塞的人心脏进行活组织检查相关的固有危险，这在患者中不能直接证实因此，我们的数据不能完全排除在到达心脏之前在血液或骨髓中的激活在这里，我们假设外周血髓样细胞在进入心脏之前表现出功能异质性，并且由于依赖于整体测量技术（例如qPCR和批量RNA-seq），在先前的研究中未被注意到。

为了检验这一假设，我们对MI后的骨髓、血液和心脏进行了单细胞RNA-seq分析（23），并确定了I型IFN信号传导在稳态和MI后的起源、调节和人类相关性我们的研究结果表明，髓系干扰素反应开始于远端骨髓，在紧急骨髓生成的起源处。

我们分析了约145，000个单细胞转录组来自小鼠和人的心脏、血液和骨髓，以确定MI后中性粒细胞和单核细胞随时间在多个组织隔室内的心内状态、轨迹和可诱导程序在急性心肌梗死患者中，我们观察到表达ISG的人外周血中性粒细胞和单核细胞的特定亚群。

在小鼠中，我们证实了这些发现，并表明ISG表达始于骨髓，在稳态时可检测到，在骨髓中受Tet 2正调节，在心脏的固有巨噬细胞中受Nrf 2负调节这些数据提供了MI后1-4天心脏、血液和骨髓的小鼠中性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞的全面的单细胞转录组学图谱。

结果1：人和小鼠心肌梗死后外周血单核细胞和中性粒细胞亚群受到干扰素刺激健康人外周血单核细胞已经使用单细胞转录组学广泛表征（24-26）;然而，尚不清楚先天免疫信号传导途径在稳态或组织损伤后是否在运输细胞中起作用。

我们收集了1例胸痛发作48小时后出现血清心肌肌钙蛋白水平升高（表明非ST段抬高型心肌梗死（NSTEMI））患者的外周血我们采集全血，进行红细胞裂解，并将所有剩余细胞重悬用于流式分选用DAPI和细胞表面CD 235 a（血型糖蛋白A）抗体对细胞进行染色，流式分选以纯化活的非双联体非红细胞（RBC），并使用市售10 X Genomics单细胞RNA-seq工作流程进行条形码编码（图1A）。

在解多路复用并定位到参考基因组后，我们进行了粗略聚类，通过规范标记的表达来广泛定义主要造血谱系（图1 S）为了研究单核细胞异质性，我们对CD 14 HIVCANHIFCN 1HI转录组进行了亚组、重标和再聚集。

这揭示了标记为A-E的五个不同亚群簇A高度表达几种干扰素刺激基因（ISG）：IFIT 1、IFIT 2、IFIT 3、RSAD 2、ISG 15、OAS 3、RSAD 2（图1C）簇B和C分别表达高水平的CYP 1B 1、RGS 2、ALOX 5AP、VNN 2、RBP 7和S100 A9、HMGB 2、S100 A12、PLBD 1、THBS 1。

簇D和E高水平表达与树突细胞相关的基因（HLA-DPA，DLA-DPB 1），并且通过FCGR 3A（也称为CD 16）和FCER 1A的差异表达来区分为了进一步研究干扰素刺激，我们构建了单细胞ISG评分，定义为最高ISG的总表达（见方法）。

ISG表达在来自簇A的细胞中与簇B、C和D相比显著升高，但与树突状细胞簇E相比没有显著升高这与Villani等（25）的结果一致，其显示人树突细胞的亚群也表达ISG我们接下来生物信息学分离定义为CAMPHILCN 2 HIMMP 8HI的嗜中性粒细胞。

人们对人外周血中性粒细胞的单细胞转录组知之甚少，因为它们通常被商业临床收集管丢弃MI后中性粒细胞的无偏倚亚聚类显示IFN诱导（ISG+）和未诱导（ISG−）群体跨越成熟谱（图1F-H）在小鼠中，我们检测到MO后ISG+和ISG−中性粒细胞和单核细胞的类似亚群。

外周血（图1I）总之，这些结果表明，MI后人外周血中含有ISG+ IFN诱导的细胞（IFNIC）和ISG−未诱导的中性粒细胞和单核细胞髓系细胞

心内中性粒细胞可分为镜像ISG+和ISG−亚群接下来我们将注意力转向梗死心脏内的骨髓细胞中性粒细胞是无菌组织损伤（如MI）的短期第一反应者与单核细胞和巨噬细胞相比，人们对中性粒细胞进入受损心脏后如何分化和特化知之甚少（27，28）。

为了探索MI诱导的异质性，我们永久性结扎左冠状动脉，并在MI后第1、2和4天（D1、D2和D4）从冲洗和酶消化的梗死心脏中FACS分选活的单个非红细胞（DapiLOW、Ter 119 LOW），用于单细胞RNA测序（图S2 A、B）。

所得转录组的粗聚类和生物信息学子集显示，梗死心脏内第1天的分布以中性粒细胞为主，第4天的分布以单核细胞-巨噬细胞为主，与先前报告的免疫表型和流式细胞术数据一致（图S2 C-E）（2）我们对中性粒细胞（S100 a8、S100 a9、Retnlg、Mmp 9、Cxcr 2）HI进行生物信息学亚组，将其重新归一化、缩放并重新聚类为统一数据集（图1）和逐个样本（图S2）。

这显示了5个心内中性粒细胞亚群在MI后D1和D4之间具有不同的时间模式（图2A-F、图S2、表S1）亲代中性粒细胞亚群（Hrt-N1）以Retnlg高表达为特征，在每个时间点存在于每份样本中，表型反映了外周血中性粒细胞（图2A-F、图S2、表S1）。

Hrt-N2中性粒细胞早在MI后第1天表达ISG，晚在第4天表达ISG（图2A-F、图S2、表S1）这是出乎意料的，因为先前的工作仅发现ISG在单核细胞衍生的梗死巨噬细胞中表达（21，22）我们将这些细胞命名为中性粒细胞IFN诱导细胞（nIFNIC）。

Hrt-N3亚群表达与NF-κB活化相关的基因，包括Nfkb 1、Icam 1、Il 1a、Sod 2和Tnip 1（图2A-F、图S2、表S1），而Hrt-N4群体表达与HIF-1α活化相关的基因，包括Egln 3、Hilpda和Vegfa（图2A-F、图S2、表S1）（29）。

Hrt-N3和Hrt-N4均在第1天显著，但在第4天下降，与新的中性粒细胞亚群（Hrt-N5）的出现一致，其特征为Siglecf表达（图2A-F，图S2，表S1）尽管SiglecF是最著名的嗜酸性粒细胞标记物，并且在流式分选嗜中性粒细胞时经常被选通，但是最近在鼠肺癌背景下的单细胞转录组学分析鉴定了类似的表达SiglecF的嗜中性粒细胞（30，31）。

事实上，我们能够使用表面抗体染色证实中性粒细胞（Cd 11b+、Ly 6 G+）可分为SiglecFHI和SiglecFLOW亚群，这允许FACS分选和单细胞RNA-seq结果的qPCR验证（图S3）这些结果证明中性粒细胞随时间推移在功能上是异质的，并且当认为重构由巨噬细胞主导时，SiglecFHI中性粒细胞可能在免疫应答的晚期在梗死中发挥未被识别的作用。

由于我们和其他人之前发现I型IFN信号传导在MI后是有害的（21，22），我们询问ISG+和ISG−中性粒细胞之间是否存在任何潜在差异令人惊讶的是，当我们用生物信息学方法分离并重新聚集ISG+中性粒细胞时，我们恢复了ISG−群体中存在的所有相同的可诱导中性粒细胞状态（图2G）。

为了研究中性粒细胞亚群之间的转换，我们进行了对心肌梗死后第4天数据的下采样细胞群（n = 5，000个细胞）进行伪时间轨迹分析（Monocle 3.0）（32）无论是一起分析还是单独分析，ISG+和ISG-中性粒细胞都遵循镜像轨迹（图2 H），这进一步证实了ISG表达与中性粒细胞分化的其他轴正交的观点。

为了研究ISG表达如何沿着中性粒细胞成熟轴变化，我们将其与Retnlg和Siglecf的表达进行了比较（图2 I），Retnlg和Siglecf是早期和晚期心内分化的标志物我们发现最近浸润的RetnlgHISiglecfLOW中性粒细胞表达最高水平的ISG，提示ISG表达在进入梗死心脏之前被诱导。

总之，这些结果提供了梗死心脏内中性粒细胞分化的第一个详细图谱，并表明ISG表达不限制心内分化潜力此外，这些数据揭示了一种以前未被认识的晚期Siglecf+中性粒细胞，其功能尚未被探索

心内单核细胞和巨噬细胞可分为镜像ISG+和ISG−亚群以及一个非镜像（ISG-）稳态巨噬细胞亚群接下来，我们检测MI诱导的心内单核细胞和巨噬细胞异质性我们先前发现梗死心脏中表达ISG的单核细胞和巨噬细胞依赖于转录因子干扰素调节因子3（Irf3）和I型干扰素受体（Ifnar）。

因此，我们在WT小鼠以及Irf3 −/−、Ifnar −/−和抗Ifnar抗体处理小鼠中诱导MI，并整合所得单细胞转录组学数据集（图3A、图S4）我们鉴定了6个单核细胞亚群：Hrt-m1单核细胞（表达Ccr2、Plac8和Ms4a4c，其转录表型复制外周血单核细胞）;ISG + Hrt-m2群体（Hrt-m2）;以及以下巨噬细胞亚群-Hrt-M3（表达Arg1和Vegfa）;Hrt-M4（表达Gclm和Slc40a1，我们后来揭示其是Nrf2活化的巨噬细胞）;Hrt-M5（表达C1qa、C1qb、Mrc1和Ctsd，包括Ccr2 −驻留巨噬细胞）;和Hrt-M6（表达抗原呈递基因）（图3B、C，图S4A、B、C，表S2）。

我们将ISG + Hrt-m2细胞命名为单核细胞衍生的干扰素诱导的细胞（mIFNIC）以区别于中性粒细胞IFNICHrt-M5（C1qaHI）和Hrt-M6（H2.AaHI）是稳态心脏的主要巨噬细胞亚群（图3D、图S4E）。

独立分析时，未梗死小鼠的巨噬细胞亚群分为Ccr2 − MHCII −、Ccr2 − MHCII+和Ccr2+亚群，与之前的报告一致（图S5A、B）（33）鉴于Hrt-m2、-M3和-M4的患病率从梗死前到梗死后急剧增加，我们推断Hrt-m2、-M3和-M4是MI诱导的状态（图S4E）。

Hrt-m2（ISG+）的ISG表达细胞占稳态巨噬细胞的〈〈1%，但占MI后单核细胞的~8%在抗Ifnar抗体治疗的Ifnar −/−和Irf3 −/−小鼠的梗死心脏中，几乎完全不存在这一群体（图3E）。

作为聚类的替代方法，我们计算了每个样本中每个细胞的ISG评分，结果显示，与梗死前、抗Ifnar抗体处理的Ifnar −/−和Irf3 −/−单核细胞相比，WT MI后单核细胞中的ISG表达显著较高（图3F，G）。

为了探索ISG+单核细胞的分化潜能，我们对它们进行了生物信息学分离、重正化、重标和再聚集ISG细胞自发聚集成相同的ISG −亚群，但一个未表征的巨噬细胞亚群Hrt-M4除外（图3H、图S6）总之，这些数据表明ISG在单核细胞到达梗死心脏之前以Irf3 −和Ifnar依赖性方式被诱导。

曾经在心脏、ISG+和ISG−单核细胞具有相似的分化潜能，但Hrt-M4巨噬细胞除外由于其独特的不对称性，我们将注意力转向未表征的Hrt-M4巨噬细胞

MI诱导稳态巨噬细胞Nrf2活化，负性调节浸润髓系细胞的IFN应答我们注意到之前Hrt-M4标记基因的基因与cytoprotective转录监管机构Nrf2(核转录因子(erythroid-derived 2)——2)基于染色质免疫沉淀反应实验和Nrf2-binding抗氧化剂的存在响应元件(是)启动子序列(34-36)。

确定Nrf2-dependent Hrt-M4巨噬细胞的数量,我们受到Nrf2−−/小鼠心肌梗死和综合结果与WT预处理和postinfarction单细胞转录组数据(图4 a、B图S7A, B,表S3)。

事实上,Hrt-M4巨噬细胞减少的百分比从< < 1% ~ 12% Nrf2−−/老鼠相对于WT(图4 c, D,图S7C-E)此外,差异基因表达分析比较Nrf2−−和WT巨噬细胞表现出显著减少子集Hrt-M4 cluster-defining基因(图4 e)。

基于标记基因的废除,我们得出的结论是,Hrt-M4细胞Nrf2-activated巨噬细胞和我们称为它的标记基因Nrf2-stimulated基因(nsg)使用NSG顶部,然后,我们创建了一个单细胞NSG得分(类似于上面的研究小组的分数),证实是显著降低Nrf2−−/ MI后小鼠相比WT(图4 f, G)。

有趣的是,核供应国集团主要是表现在Ccr2−细胞,这表明Hrt-M4巨噬细胞来源于稳态巨噬细胞而不是最近招募骨骨髓来源的巨噬细胞探索这一假设,我们分别分析了稳态的单细胞转录组巨噬细胞和识别四个亚种群之前报道:Ccr2−MHCII−, Ccr2−MHCII +,和两个Ccr2 +子集(无花果。

S5A, B) (33)NSG + (Hrt-m4)细胞表达几个标记定义独特的居民Ccr2−MHCII−巨噬细胞以及与Ccr2密切相关−MHCII−常驻巨噬细胞的斯皮尔曼等级系数分析(图4 h,图S5B-E)。

此外,isg和nsg几乎从未引起位于相同的单元中(图4)策划的研究小组和NSG分数单单核细胞相互确认的互斥表达Irf3−和Nrf2-dependent基因表达程序(图4 j)当使用拟时间放在monocyte-to-macrophage分化轴轨迹分析(单片眼镜),mi后第四天Nrf2-induced巨噬细胞与成熟的巨噬细胞有关,而Irf3-induced细胞与单核细胞(图S8)有关。

这个结果证实了基于F4/80流排序单核细胞和巨噬细胞和Ly6C表面染色紧随其后qPCR与引物对高表达了isg nsg(图4 k)综上所述,这些数据表明,Nrf2-activated Hrt-M4细胞来源于稳态巨噬细胞,ISG-NSG二分法是由细胞位置时MI(研究小组+巨噬细胞来源于单核细胞的血液和骨髓而NSG +巨噬细胞来自于稳态细胞驻留在心脏)。

Nrf 2在许多模型中通过不完全确定的机制负调节炎症（37-41）为了测试Nrf 2信号传导是否负性抑制ISG的表达，我们在体外和体内进行了机理实验用Irf 3活化环二核苷酸、环-二-GMP（cdGMP）刺激骨髓源性巨噬细胞，无论是否使用外源性Nrf 2活化4-O-衣康酸（4 OI）（40）。

尽管单独使用cdGMP可增加几种ISGs的表达，但与cdGMP和4 OI共刺激可显著减弱ISGs的诱导，同时增加NSGs的表达（图4L）在体内，我们观察到与WT小鼠相比，梗死Nrf 2缺陷小鼠的ISG水平显著升高（通过ISG评分定量）（图4 M），进一步支持了MI后ISG表达是Nrf 2依赖性的。

总之，这些结果表明，Nrf 2激活发生在梗死心脏的Ccr 2 −稳态巨噬细胞中，并在MI后对浸润的骨髓源性单核细胞和中性粒细胞中的病理性ISG表达进行负调节

ISG在到达梗塞心脏之前在鼠骨髓和血液的髓样细胞中表达由于ISG表达在心脏的多个髓系细胞（中性粒细胞和单核细胞）中被鉴定，我们假设ISG活化可能在骨髓中开始，其中髓系细胞来自共同的祖细胞（42）为了验证这一点，我们对梗死和非梗死WT和Irf 3 −/−小鼠的骨髓和血液白细胞及祖细胞进行了单细胞RNA-seq（图5A、图S9、表S4）。

解复用并定位至参考基因组后，将转录组整合至单个数据集中，并通过检查独立样品特异性UMAP中的簇代表性进行确认（图S9 A、B）我们重点关注髓系祖细胞、中性粒细胞、单核细胞（图5 B、图S9 C）在总共87，822个单细胞转录组中，我们测量了大约40，000个中性粒细胞和中性粒细胞祖细胞，它们自发地聚集成6个连续的亚群（图5C）。

通过分析与组织区室（即富含LS+/−K、骨髓和血液）相关的聚类成员，我们将聚类从未成熟（仅存在于骨髓和LS+/−K样本中）到成熟（主要存在于血液中）进行排序（图5D）我们发现ISG表达随着中性粒细胞成熟而单调增加，开始于CampHI中性粒细胞阶段或之前（图5E，F）。

当以更高分辨率（增加维度）分析时，ISG+细胞自发地与其亲代细胞群分离，并且与最成熟的中性粒细胞最密切相关（图5G）该数据表明ISG信号在早期中性粒细胞中可检测到，并随着中性粒细胞成熟而增强，直到其成为驱动聚集的变异性的重要组成部分。

我们对单核细胞进行了类似的分析总共测量了20，295个单核细胞转录组，它们自发地聚集成5个亚组（图5 H）我们根据单核细胞在骨髓和血液中的相对丰度将其从未成熟到成熟进行排序ISG表达在复制型（Top 2a、Tubb 5）HI和单核祖细胞（Fcnb、Cebpe、Ctsg）HI中最低，并随着原型单核细胞基因（Lyc 2、Ccr 2、Lgals 3）的产生而单调增加（图5 J-L）。

当在更高分辨率下分析时，ISG+单核细胞自发聚集成一个与中性粒细胞相似的独特亚群（图5L）与骨髓相比，从外周血中分离的中性粒细胞和单核细胞中ISG表达显著更高，与MI后的时间无关（图5 M）即使在稳定状态下，我们也能在未受伤小鼠的骨髓和外周血中检测到ISG+髓样细胞。

为了确定这一发现是否也适用于人类，我们分析了几项先前发表的健康人外周血单核细胞研究，并在分析的6名健康受试者中的4名中发现了独特的ISG簇（URL：https：//support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets）[2018年6月访问]。

这是未测量的环境刺激的结果还是正常造血的一部分仍不清楚（图9 S）在小鼠中，无论是在稳态时还是MI后（D2）分析，IFN应答均为Irf 3依赖性，与WT小鼠相比，Irf 3 −/−小鼠骨髓和血液中ISG的表达显著降低（图5 N）。

在两个髓系的镜像亚群中观察到成熟依赖性ISG表达，最简单的解释是激活开始于粒细胞-单核细胞祖细胞（GMP）或之前当我们分离LS+/−K富集样本时，我们无法检测到早期造血细胞中ISG表达增加（图S9 E）;然而，这不排除ISG在GMP阶段的活化，因为细胞随着ISG表达的增加而成熟。

相反，可能需要更灵敏的试验来检测诱导后最早时刻预期的微小信号然而，我们的数据表明，干扰素诱导的中性粒细胞（nIFNIC）和单核细胞（mIFNIC）在骨髓中远离损伤部位开始，在稳态和MI后均是如此，并且ISG表达随着髓系细胞成熟而增加，直到其变得足够明显而引起自发聚集。

将促炎性I型IFN应答定位于骨髓后，我们接下来检查了病理性过度炎症骨髓的已建立模型是否可能涉及髓样I型IFN信号转导的改变

Tet2缺乏增加骨髓髓系祖细胞及其后代中性粒细胞和单核细胞自发ISG表达克隆性造血是一种与年龄相关的疾病，可导致骨髓偏倚、炎症过度表型、心血管事件风险增加和人类死亡率增加（43，44）TET 2（Tet甲基胞嘧啶双加氧酶2）是一种对转录具有广泛影响的表观遗传修饰因子，其功能丧失是与人类克隆性造血相关的最常见突变之一。

对TET 2突变患者和Tet 2缺陷小鼠的机制研究采用了一种候选方法，重点关注单核细胞衍生的巨噬细胞、IL-6、IL-1β和炎性小体（44-46）;然而，其它细胞类型（例如嗜中性粒细胞）和先天免疫途径（例如I型IFN）的重要性仍未被探索。

我们假设Tet 2缺陷小鼠骨髓单核细胞和中性粒细胞中可能存在异常的I型IFN先天免疫激活为了验证这一点，我们在稳态和MI后对Tet 2 −/−小鼠骨髓中的髓系细胞进行了单细胞RNA-seq与WT小鼠相比，在稳态和MI后，我们观察到髓系祖细胞及其中性粒细胞和单核细胞子代中ISG表达的自发诱导增强（通过ISG评分定量）（图6A-D、图S10、表S5）。

总之，这些数据表明IFN信号传导可能是Tet 2相关病理学的促炎介质

讨论：总之，我们的数据表明，I型干扰素对缺血性心脏损伤的反应始于骨髓，远离组织损伤部位，是紧急骨髓生成的起源我们确定这种反应不仅发生在单核细胞和单核细胞衍生的巨噬细胞，而且也发生在中性粒细胞我们发现，Tet2缺陷小鼠骨髓中I型干扰素应答增强，受Ccr2−稳态心脏巨噬细胞的Nrf2依赖性信号负调控，并且具有Irf3−和IFN α依赖性（图7）。

我们的发现具有转化意义，因为I型干扰素应答以前被认为在心脏内无法诊断，而现在在急性心肌梗死患者的临床可及外周血中性粒细胞和单核细胞中很容易定量（通过计算单细胞ISG评分）在我们的研究中，单细胞转录组学对于区分ISG+和ISG−髓系亚群至关重要，因为缺乏用于该途径流式细胞术分析的敏感性和特异性抗体，而且整体测量技术模糊了单个髓系细胞亚群的相对贡献（47，48）。

这种功能异质性具有病理学意义，因为ISG包括许多促炎细胞因子和趋化因子基因（18，48），并且因为我们先前发现IFN信号传导的遗传或药理学抑制可减少MI后炎症并防止心室破裂导致的不良心室重塑和死亡（21）。

我们的研究结果为未来的研究提出了几个机制问题干扰素信号是如何在骨髓髓系祖细胞亚群中启动的，它是如何避免在所有成熟髓系细胞中被激活的？先前的研究表明，可溶性刺激物如外源性poly（I：C）（18，49）或IFN-α（49）和内源性IL-1β（50）可诱导骨髓干细胞和祖细胞增殖，但未显示它们产生ISG极化亚群。

目前尚不清楚全身性和扩散性物质如何激活部分（而非全部）中性粒细胞和单核细胞中ISG的表达交感神经系统激活和肾上腺素能信号传导可提供时空定位的诱导机制，如接近血管系统或另一骨髓小生境，但这些之前与I型IFN信号传导或ISG表达无关（51，52）。

浆细胞样树突状细胞参与强直性IFN信号传导（53），并可构成局部引发髓系祖细胞的骨髓生态位我们和其他人观察到心肌梗死后Cgas−/−小鼠心脏中ISG的表达降低，这表明胞质DNA感应可能发挥了重要作用（21，22）。

cGAS依赖性DNA传感下游的Irf 3激活信号是间隙连接可渗透的，并且可以介导与骨髓生态位（56，57）的细胞的接触依赖性细胞间通讯（54，55）或者，DNA损伤（58）、微核（59，60）或一过性核破裂（61，62）导致的细胞自主Irf 3激活可产生IFN诱导细胞的异质性群体。

最后，Tet 2缺陷小鼠骨髓中自发性I型IFN活化增强的鉴定表明，IFN可能在介导人类克隆造血炎症中发挥未被重视的作用（44，63）从临床角度来看，我们的数据提供了I型干扰素信号传导在人类MI后外周血中性粒细胞和单核细胞中可检测到的直接证据。

使用单细胞转录组学定量外周血白细胞亚群中ISG表达的能力将能够与临床结局和对治疗的应答相关联使用单细胞ISG评分作为生物标志物，现在可以检测I型干扰素对MI过度应答的患者是否可能在心律失常、心力衰竭、复发性MI和总生存率方面具有更差的临床结局。

由于我们能够在稳态时检测到小鼠骨髓和血液中的ISG+髓系细胞，因此将稳态ISG评分与已确定的炎症生物标志物（例如C反应蛋白）和心血管风险进行比较将是有趣的（64，65）最近的研究表明，靶向IL-1β的抗细胞因子治疗可减少人类复发性心血管事件，并表明过度炎症驱动病理的患者亚组可观察到优先获益（66）。

现在可以测试ISG评分的量化是否可以识别可能优先受益于抗细胞因子或免疫调节治疗的患者最后，如果ISG评分预测患者结局较差，则可使用抗IFNAR抗体治疗检测ISG的因果关系，在最近报告的阳性狼疮III期临床试验中，抗IFNAR抗体治疗在长期给药期间显示出可接受的安全性特征（20，67）。

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