今天推送的文章发表在ACS.Catal..上的“One-Pot Enzymatic Conversion of Sucrose to Synth

 

今天推送的文章发表在ACS.Catal..上的“One-Pot Enzymatic Conversion of Sucrose to Synthetic Amylose by using Enzyme Cascades

”，作者为弗吉尼亚理工大学生物系统工程系彭琪等人合成直链淀粉可能是一种非常重要的化合物，作为低氧扩散可生物降解的前体塑料薄膜、健康食品添加剂和潜在的高密度氢载体在这项研究中，一锅反应由蔗糖磷酸化酶和马铃薯α-葡聚糖磷酸化酶或辅以其他三种酶（即葡萄糖。

异构酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶）将廉价的蔗糖转化为合成的直链淀粉，而一种葡萄糖来自蔗糖的单元被添加到引物-麦芽糊精的非还原端从嗜热菌热厌氧菌JW/SL-YS485中克隆出耐热蔗糖磷酸化酶 kcat 和 Km 的值。

蔗糖在 37°C 下分别为 15.1 s-1 和 20.2 mM，该酶在 70°C 下的半衰期为 3.1 小时用葡萄糖异构酶、葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶去除蔗糖中蔗糖磷酸化酶抑制剂果糖时，合成直链淀粉的产量没有显著提高。

这一结果表明，具有高果糖解离常数(34.4mM)的蔗糖磷酸化酶的双酶体系不需要其他三种酶来减轻产物抑制通过调整引物麦芽糊精浓度和反应时间，将合成直链淀粉的平均聚合度从33控制到262

作者设计了由多达5种酶组成的一锅级联反应，将蔗糖转化为合成的直链糖（图1）该级联反应有三个模块：（1）蔗糖被蔗糖磷酸化酶磷酸化为果糖和果糖(EC2.4.1.7)；（2）葡萄糖转移酶家族葡萄糖磷酸化酶(α-葡聚糖磷酸化酶，PGP，EC2.4.1.1)合成直链糖；（3）通过葡萄糖异构酶(GI，EC5.3.1.5)、葡萄糖氧化酶(GO，EC1.1.3.4)和过氧化氢酶(CA，EC1.11.1.6)缓解果糖对SP的抑制。

在这个系统中，磷酸盐离子被内部循环利用，以维持磷酸盐水平这一设计的途径完全不同于植物中由两种酶介导的天然淀粉生物合成途径：合成糖核苷酸前体的adp-葡萄糖焦磷酸化酶和淀粉合成酶，后者利用ADP-葡萄糖延伸-1,4链葡聚糖链。

SP和PGP催化的概念验证实验在以下条件下进行：100μL的100mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，含50mM蔗糖，10mM磷酸钠，100μM麦芽糊精，1mg/mL SP，1mg/mL PGP在37°C（图2）。

由于PGP、GI、GO和CA不耐热，所以选择温度为37°CTris-HCl缓冲液与之前使用的HEPES缓冲液相比，其成本较低重组PGP通过咪唑纯化，该蛋白可以与微型支架蛋白的内聚蛋白结合，微型支架蛋白通过对再生非定形纤维素的高亲和力吸附而降低，如前所述。

重组的SP和PGP以及迷你支架蛋白在SDS-PAGE中被纯化为均质蛋白(图2a，1和3)起初，含有蔗糖和短链的混合物麦芽糊精作为引物在碘存在下是无色的(图2a)12h后，溶液在碘存在下呈现深蓝色，表明形成了合成直链糖(2)。

该合成的直链糖通过加入乙醇(3)沉淀用13C NMR和FTIR也证实了游离直链淀粉蛋白(图S4)当合成的直链淀粉溶液用10U的α淀粉酶处理数小时时，该溶液在碘(4)的存在下是无色的这一结果表明，淀粉1、4糖苷键连接的合成直链糖被淀粉酶水解。

被阿尔法淀粉酶水解的直链糖，即短链麦芽糊精，不能通过添加乙醇(5)沉淀

在100mM蔗糖(即200mM葡萄糖当量)上的双酶(即SP和PGP)体系中，磷酸盐浓度优化，磷酸盐和双酶负荷优化选择所用的SP单位与PGP的单位相同，确保蔗糖光酰化和直链糖合成的反应速率匹配当5个单位SP和PGP每个使用，过低的磷酸盐水平导致缓慢的初始蔗糖裂解率，因为磷酸盐是SP的底物，而过度磷酸盐水平导致直链淀粉合成速度慢，因为磷酸盐是一个抑制剂PGP直链淀粉合成方向。

最佳磷酸盐浓度为50mM为保证反应在24h内完成，发现SP和PGP的酶载量均为5U/mL，SP和PGP的双载量没有显著提高产率最佳反应条件为50mM磷酸钠、200μM麦芽糊精、5U/mL SP和5U/mL PGP，37°C、25小时时，反应混合物中葡萄糖当量的直链糖浓度达到32.3mM(图3a)。

因为蔗糖水解利用效率为72.9%

为了降低果糖对SP的抑制作用，作者加入了另外三种酶(即20U/mL GI、20U/mL GO和30U/mL CA)，得到了五酶体系在该体系中，果糖被GI催化为葡萄糖，葡萄糖被氧化石墨烯氧化为葡萄糖酸和过氧化氢，过氧化氢被CA降解为水和氧。

当五酶体系中的蔗糖浓度从100mM下降到20.8mM时，葡萄糖当量的直链糖浓度达到34.7mM(图3b)与双酶体系相比，五酶体系的蔗糖水解效率从72.9%提高到79.2%，但直链淀粉产量几乎没有变化虽然其他三种酶的添加略有增加蔗糖转化，但降低了G-1-P合成直链糖的利用效率(即45.5mM G-1-P)，可能是由于自由基过氧化氢的轻微负面影响，可能降低其他酶的活性和稳定性，虽然添加了CA去除水。

这一结果与添加GI、GO和CA几乎使纤维二糖的直链淀粉产量增加一倍的结果完全不同此外，该SP被果糖竞争性抑制，KI值高达34.4mM由于果糖的高值KI，去除果糖对提高合成直链糖的产量不有效因此，与五酶系统相比，双酶系统具有多种优势，如使用的酶较少，。

且在长期内可能具有更好的酶稳定性 进一步研究了酶体系中添加的初始引物（麦芽糊精）对合成直链糖DP的影响由于五酶体系在直链淀粉产量方面比双酶体系没有明显的优势，因此采用了简单的双酶体系当引物浓度从10μM麦芽糊精改变到1000μM麦芽糊精(图4a)时，合成直链糖的平均DP数从262下降到33(图4a)。

当引物浓度低于200μM时，合成直链淀粉的重量产量较低，表明引物含量有限用于在此条件下合成直链淀粉此外，合成的直链淀粉的聚合程度也可以由双酶体系的反应时间来控制(图4b)当引物浓度为200μM时，合成直链淀粉的DP在3小时时分别为26.7,10小时时为57,150小时时为150,25小时时为161。

PGP介导的蔗糖合成直链糖的平均DP数受实验条件，如引物浓度和反应时间等的控制据文献记载，PGP催化的G-1-P合成的直链淀粉分散度较低，即重量平均分子量与数量平均分子量的比值因此，该研究计算了合成直链淀粉的分子量在5370~42514之间，而平均聚合程度为33~262。

从不使用多糖标准的情况下可以测量的数字平均DP计算出的分子量可以比使用尺寸排除色谱或核磁共振分析测量的数据更精确，这两者都在很大程度上依赖于标准样品根据合成直链淀粉的纯度和DP，从高价值到低价值产品有多种应用。

由于缺乏大量的由短到长控制的合成直链糖，这减缓了这种新型多糖的应用发展优质的高DP直链淀粉可作为制药行业的色谱柱基质和药物胶囊材料直链淀粉也被称为一种高性能材料，因为它作为一个宿主分子，由于其螺旋构象，通过包含各种客体分子来形成直链淀粉超分子。

高DP直链淀粉可以作为制造生物可降解薄膜和薄片的起始材料，这已经占了十亿美元生物塑料市场的一半食品级直链淀粉可与谷物混合，制作定制食品这种食物可能的血糖负荷较低，这可能会改善人类健康，并降低一些严重疾病的风险，如糖尿病和肥胖。

蔗糖磷酸化酶是一种很有前途的可进行多种底物糖基化的生物催化剂先前研究的缺乏热稳定性的中温sp限制了其应用为了提高其稳定性，可以通过将中温SPs固定在固体载体上或通过蛋白质工程来提高中温SPs的稳定性例如，最稳定的SP突变体在70。

°C下孵育1小时后，保留了不到其原始活性的5%自然界中的嗜热生物可以是简单和节省时间据知，该酶来自热糖溶球菌JW/SL-YS485，是已报道的第一个耐热SP，在70°C下的半衰期为3小时为了扩大合成直链淀粉的生产，廉价的蔗糖是一种比昂贵的纤维二糖或纤维素通过特殊和昂贵的纤维素酶混合物部分酶水解的更有吸引力的水解产物的底物。

除了直链淀粉外，果糖的副产物也是一种有用的甜味剂由于这种双酶系统不涉及昂贵且不稳定的辅酶(如NAD(P)和CoA)和ATP，当SP和PGP都足够稳定时，这种转化可能对合成的直链糖和果糖有潜在的工业应用整理：

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