常百金，唐志书，邱智东，刘妍如，宋忠兴，贾艾玲，长春中医药大学

 

摘  要：目的基于“成分反映活性，活性指向功效”的中药质量控制研究思路，建立用于柴胡Bupleurum chinense等级评价的二分类Logistic模型，并开发出一种柴胡等级评价计算器方法 采用二分类。

Logistic算法将柴胡的柴胡皂苷a、d含量、环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）生物效价、ABTS+清除率、DPPH∙清除率和羟自由基清除能力等指标进行关联分析，建立用于柴胡的等级预测模型，并进行验证。

采用多元回归分析方法、二分类Logistic回归模型结合柴胡成分-药效相关数据，建立等级评价方程采用JavaScript和CSS3技术，将等级评价方程嵌入HTML进行计算器插件的开发结果  Logistic。

预测模型概率公式初步将15个产地来源柴胡最终分为优、良、中、差4级，各批次所对应的预测归属等级明确，拟合概率P值均大于90%开发了一种无需将数据传给服务器端，通过动态地输入测定的数据，可直接输出柴胡等级评价结果的计算器。

结论 首次将柴胡功效-成分相结合，建立评价柴胡质量等级的方法，可为柴胡质量评价提供重要依据；并开发出一种基于“药效-成分”相关联的柴胡质量等级快速评价的计算器插件。

柴胡Bupleuri Radix（BR）为伞形科柴胡属植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡B. scorzonerifolium Willd.的干燥根[1]，按性状不同，分别习称“北柴胡”和“南柴胡”。

柴胡具有解热、保肝、抗炎、抗肿瘤、免疫调节、抗抑郁等多种药理活性[2]药用植物资源丰富、分布广，临床应用常以北柴胡为主，且长期以来在民间传统医学中用作消炎药、解热药和镇痛药[3]主要分布于我国东北、华北、西北、华东和华中各地。

目前，柴胡质量控制主要参考《中国药典》2020年版，以单一成分柴胡皂苷a、d含量作为主要质控指标其混淆品小叶黑柴胡的柴胡皂苷a、d含量也符合《中国药典》2020年版[4]因此，单一成分并不能全面地反映药材内在质量，且中药的化学物质实体与生命体分子网络的交互作用具有模糊性、难以定量等特点。

[5]故需要根据成分与药效间多维度、多层次的相互作用对柴胡质量进行全方位评价目前，柴胡只有选货和统货的区别，随着野生资源的减少，药材市场上以栽培品为主，造成品种混乱，质量参差不齐，无明确区分柴胡质量等级的方法，若以柴胡皂苷。

a、d含量高低对市场上的柴胡进行分类可能具有一定的片面性，故将柴胡主要活性成分及药效作为评价指标，其中柴胡皂苷a、d质量分数较高，具有良好的抗炎活性[6-8]已有研究表明[9]环氧化酶（cyclooxygenase。

，COX）是柴胡抗炎作用机制之一，它是花生四烯酸代谢和多种炎症介质（前列腺素和血栓素A2）生物合成过程中重要的限速酶之一，具有2种亚型即COX-1和COX-2COX-1是机体固有的酶，在正常情况下存在于胃肠道、肾脏和血小板等组织细胞，不能被诱导增加，通过促进前列腺素及血栓烷。

A2的合成，发挥保护胃黏膜、维持肾血流量、调节血小板聚集、外周血管张力等内环境稳定的作用而大多数细胞中不出现COX-2，可在生长因子、细胞因子、细胞毒素、致炎物质等刺激下表达，产生的底物前列腺素可引起炎症、疼痛、发热反应，这与柴胡传统应用于抗炎解热的作用相符合。

[10]因此，通过测定对COX-2的抑制作用，可用于评价柴胡抗炎活性除此之外，柴胡在抗氧化方面具有较强的药理作用[11-12]研究表明，氧化应激和炎症被认为是各种疾病病理的核心机制，持续活跃的炎症反应可导致活性氧的过度产生，诱导氧化应激，使细胞受到氧化损伤，同时产生炎症。

因此，将氧化应激和炎症与柴胡成分结合用于综合评价柴胡质量，具有高度的代表性故本研究对不同批次柴胡中的柴胡皂苷a、d含量及COX-2的生物效价和抗氧化效果进行测定[13]，通过Logistic算法建立模型并进行验证。

本课题组前期对相关药材等级评价[14-16]积累了丰富经验，建立了以“成分-体外效价-等级品质”网络为反映体系的分级体制[17-18]，可对不同产地来源的柴胡进行等级分类，为柴胡质量评价研究提供依据；并开发出一种柴胡质量等级快速评价的计算器插件，为拓宽中药质量等级快速评价方法提供参考。

1仪器与试药1.1仪器Agilent 1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；FW-400AD型高速万能粉碎机，天津鑫博得仪器有限公司；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；Multskan Go

酶标仪，美国赛默飞世尔公司；Sartorius CPA225D十万分之一电子天平，德国赛多利斯科学仪器有限公司1.2材料对照品柴胡皂苷a（批号110777-201912，质量分数≥98%）、柴胡皂苷d（批号

110778-201912，质量分数≥98%），购自中国食品药品检定研究院；总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）、羟自由基（OH·）测试试剂盒、DPPH自由基（DPPH·）清除能力试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；

COX-2抑制剂筛选试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司。柴胡主要收集于陕西省，经陕西中医药大学白吉庆副教授鉴定为伞形科植物柴胡B. chinense DC.的干燥根，具体信息见表1。

2方法与结果2.1溶液的制备2.1.1供试品溶液的制备[1]将药材粉碎，过四号筛，精密称定0.50 g药粉，加入含有5%浓氨水的甲醇溶液25 mL，超声30 min，滤过，滤液用25 mL甲醇洗涤药渣2

次，合并滤液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定容至5 mL量瓶中，即得2.1.2对照品溶液的制备精密称定柴胡皂苷a或d适量，加甲醇溶解，分别制成含1.03 mg/mL柴胡皂苷a及1.08 mg/mL柴胡皂苷d的溶液，即得。

2.2色谱条件色谱柱为Agilent 5TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为水-乙腈，梯度洗脱：0～50 min，25%～90%乙腈；50～55 min，90%乙腈；55～57 min

，90%～25%乙腈；进样体积10 μL；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长210 nm。柴胡皂苷a、d对照品及柴胡样品的色谱图见图1。

2.3方法学考察2.3.1线性关系考察分别精密移取“2.1.2”项下柴胡皂苷a、d的对照品溶液，稀释成2、4、8、16、32倍，按“2.2”项下色谱条件进样测定以进样量为横坐标（X）、峰面积为纵坐标（Y

）进行线性回归分析所得柴胡皂苷a回归方程为Y＝2702 X＋105.2，r＝0.999 9，表明线性关系良好，线性范围0.032～1.030 mg/mL；柴胡皂苷d回归方程为Y＝  3020 X＋63.75。

，r＝0.999 8，表明线性关系良好，线性范围0.033～1.080 mg/mL2.3.2精密度考察吸取“2.1.2”项下对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续测定6次，结果显示柴胡皂苷a、d峰面积。

RSD分别为0.22%、0.63%，表明该仪器精密度良好2.3.3稳定性考察按“2.1.1”项下方法制备供试品溶液（S2），分别于制备后0、4、8、12、16、24 h时，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，结果显示间隔进样所测得柴胡皂苷。

a、d峰面积的RSD分别为2.00%、2.94%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好2.3.4重复性考察按“2.1.1”项下方法制备6份供试品溶液（S2），按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。

结果显示柴胡皂苷a、d峰面积的RSD分别为1.46%、2.31%，表明方法重复性良好2.3.5加样回收率考察取柴胡皂苷a、d含有量已知的同一批样品（S2）约1 g，称取6份，精密称定，分别加入与样品中柴胡皂苷。

a、d含量相等的对照品，再按照“2.1.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，记录峰面积，计算加样回收率测得柴胡皂苷a、d的平均加样回收率分别为98.90%、100.17%，RSD分别为

2.35%、2.27%，表明回收率良好2.4含量测定各批次柴胡，按“2.1.1”项下制样方法平行制备3份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，计算柴胡皂苷a、d的含量各批次柴胡中柴胡皂苷a、d的含量见表

2。除S15批次柴胡外，其他所有批次柴胡皂苷a、d含量均符合《中国药典》2020年版的规定。

2.5柴胡抑制COX-2活性评价2.5.1对照品溶液的制备精密移取COX-2试剂盒中塞来昔布适量，加COX-2试剂盒中缓冲液溶解，用缓冲液将阳性对照品塞来昔布稀释成6.25、12.5、25、50、100 nmol/L

的溶液作为对照品溶液2.5.2供试品溶液制备各批次柴胡药材按“2.1.1”项下方法制备，所得溶液于水浴锅上挥干（温度不高于60 ℃）精密加入1 mL COX-2试剂盒中的缓冲溶液溶解，3500 r/min。

离心10 min得柴胡提取液，并用缓冲溶液逐级稀释，剂间比22.5.3量效考察用缓冲溶液稀释“2.5.2”项下制备的S2柴胡的供试品溶液6次，剂间比2，质量浓度依次为100、50、25、12.5、6.25。

、3.125 mg/mL将此6个质量浓度样品按照COX-2试剂盒说明书方法平行测定3次（C-1～3），结果见图2由图2结果可知，柴胡（S2）提取液质量浓度在3.125～25 mg/mL时，对COX-2抑制作用具有明显的剂量相关性，且测定结果的重复性较好。

样本对COX-2酶活性的抑制率计算公式如下。

抑制率＝(酶活性对照荧光－样品荧光)/(酶活性对照荧光－空白对照荧光)2.5.4生物效价计算方法根据试剂盒说明书方法测定，计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，依据荧光值的变化，计算每个样品不同浓度的抑制率。

设定塞来昔布对照品的参比效价值为1000 U，将供试品测试质量浓度和相应的抑制率输入生物效价计算软件（TDM），计算不同产地柴胡样品对COX-2的生物效价2.5.5不同批次柴胡样品对COX-2生物效价测定。

将15批柴胡样品按“2.5.2”项下方法制备并稀释，严格按照试剂盒说明书操作测定，按照“2.5.4”项下方法计算柴胡对COX-2的生物效价，结果见表3。

2.6柴胡抗氧化活性测定2.6.1供试品溶液制备参照“2.1.1”项方法制备2.6.2抗氧化能力测定参考谈利红等[20-21]的抗氧化活性测定方法，严格按照试剂盒操作，测定各批次样品的ABTS+、DPPH·。

和OH·的清除率，结果见表4。

由表2～4可知，柴胡皂苷a、d含量最高的，其COX-2生物效价以及抗氧化活性并非最高，不能完全通过柴胡皂苷a、d含量的高低评价药材质量的优劣，故本研究采用成分-药效相联合的方式综合评价药材质量2.7  。

主成分分析（principal component analysis，PCA）PCA是一种应用十分普遍的线性降维算法它是在原有n维特征的基础上重建的k维特征，在损失最少信息的前提下把多个指标转化为几个综合指标的多元统计方法。

[22]将不同批次柴胡的柴胡皂苷a、d的含量、COX-2生物效价和抗氧化活性数据进行标准化处理后，导入Simca-p 14.1软件，以柴胡皂苷a、d含量，COX-2生物效价，OH·抑制率，ABTS+抑制率及

DPPH∙抑制率这6个影响因素作为观测值（X）进行PCA提取前2个主成分得到模型拟合度为92.34%，说明模型拟合能力良好，各主成分贡献率见表5PCA将各批次柴胡药材分组得到散点图（图3）对各批数据进行层次聚类分析（。

hierarchical clustering analysis，HCA，图4）样本被自动分为5类，柴胡各等级间有明显的分类距离S2、S6、S11被归为一类，S14、S3、S8、S7被分为一类，S1、S9

、S13、S10被分为一类，S12、S5、S15被归为一类，S4被分为一类。结果表明，采用PCA的分类分析具有较高的可靠性。

2.8柴胡等级预测2.8.1  Logistic模型建立[14-16]令Y＝1，2，3，4，表示柴胡药材的4个等级常用的Logistic回归模型：ln[qi/(1－qi)]＝βi0＋β1x1＋…＋βnx

n，βi0为截距，i＝1，2，3，4；β1，…，βn为斜率系数；x1，…，xn为自变量由已有观测值能估计出βi0，β1，…，βn，从而柴胡投料药材各等级的概率P表达式如下：Pi＝exp(βi0＋β1x1

＋…＋βnxn)/[1＋exp(βi0＋β1x1＋…＋βnxn)]对于自变量x1，…，xn，由方程可以预测q1～q3，再由P(y＝1)＝q1，P(y＝2)＝q2－q1，P(y＝3)＝q3－q2预测柴胡等级概率。

2.8.2模型拟合运用Logistic模型对柴胡的数据进行回归拟合，根据不同批次柴胡样品的柴胡皂苷含量和生物活性指标测定结果，将15批实验数据集按照7∶3比例分成训练集（S3、S6、S5、S7、S8、S9

、S10、S11、S13、S15）和测试集（S1、S2、S4、S12、S14）所得概率公式对测试集进行分类，分类标准为P≥85%各个拟合批次均属于相应等级，表明结果具有高度稳定性各等级判断见表6。

2.9  柴胡等级的预测模型建立将实测的柴胡成分含量以及生物活性数据经SPSS 25处理后，实现Logistic模型参数的求解，得到模型表达式：P优＝exp(−111.127＋8.327×柴胡皂苷a含量＋

1.540×柴胡皂苷d含量－0.788×ABTS+＋1.717×DPPH·＋0.088×OH·＋0.428×COX)/[1＋exp(−111.127＋8.327×柴胡皂苷a含量＋1.540×柴胡皂苷d含量－

0.788×ABTS+＋1.717×DPPH·＋0.088×OH·＋0.428×COX)]，P良＝exp(531.191＋14.876×柴胡皂苷a含量－16.305×柴胡皂苷d含量＋7.713×ABTS

+－8.315×DPPH·－15.988×OH·－3.676×COX)/[1＋exp(531.191＋14.876×柴胡皂苷a含量－16.305×柴胡皂苷d含量＋7.713×ABTS+－8.315×DPPH·

－15.988×OH·－3.676×COX)]，P中＝exp(−511.624－4.430×柴胡皂苷a含量－0.422×柴胡皂苷d含量－6.238×ABTS+－6.106×DPPH·＋12.834×OH·

－0.924×COX)/[1＋exp(−511.624－4.430×柴胡皂苷a含量－0.422×柴胡皂苷d含量－6.238×ABTS+－6.106×DPPH·＋12.834×OH·－0.924×COX)]

，P差＝exp(1 253.319－111.641×柴胡皂苷a含量－12.988×柴胡皂苷d含量－2.283×ABTS+－15.719×DPPH·－11.627×OH·－2.489×COX)/[1＋exp(1 253.319

－111.641×柴胡皂苷a含量－12.988×柴胡皂苷d含量－2.283×ABTS+－15.719×DPPH·－11.627×OH·－2.489×COX)]，然后对测试集样本进行分类预测拟将柴胡不同批次按照优（。

I）、良（II）、中（III）、差（IV）4个等级分类，分别赋予响应值4、3、2、1将各指标实测值代入上述方程，即可对未参与模型拟合的样本进行等级测试，所有分级P值高达90%以上，表明公式可行将各指标实测值代入上式中即可计算影响因素属于各等级的概率，从而确定投料药材等级。

Logistic回归模型对上述样本的拟合结果与实际结果完全一致，说明其可以很好地表达投料药材等级分类标准2.10中药材质量等级评价计算机开发2.10.1计算器原理影响药材的因素主要分为3类：第1类是生物活性：如体外抗氧化活性、体内抗凝血活性；第。

2类是主要成分的质控含量；第3类是指纹图谱中各化合物的组成比例由于预测模型的建立和参数的确定是由数据驱动，利用药材分类标准来生成数据作为建模基础因此，将优（I）、良（II）、中（III）、差（IV）分别赋予响应值

4、3、2、1为了筛选稳定的定量指标，对中药材/饮片进行等级划分首先采用PCA对样本数据进行降维处理将贡献率高的生物活性指标及化学成分指标作为观测因子通过采用PCA和HCA结合的数据处理技术，来反映药材。

/饮片成分和活性差异根据不同批次药材/饮片活性、成分可以初步观察到药材/饮片的分类情况，并结合Logistic回归方程进行等级划分计算公式见“2.9”项2.10.2插件开发结果根据柴胡等级计算插件开发程序流程如图。

5所示，对流程中每个步骤进行模块化的结构设计，程序结构清晰，调用方便，原始数据和输出结果的显示均在视图类中完成计算器链接如下：http://cxzx.sntcm.edu.cn/jsq/ranking.html。

。

3讨论3.1柴胡等级划分与性状指标的关系柴胡作为临床常用中药材，具有较高的药用价值，但目前记载的柴胡道地产区过多、没有科学指导下培育的移栽品、次品与伪品充之都将造成柴胡药材市场上品种混乱，导致质量参差不齐，在性状上难以分辨真伪。

传统经验鉴别方法是药材鉴别的精髓，方法虽好，但需要专业型人才，而且药材品种繁多，形态各异，尤其药材经炮制加工后改变其形状、性味，使药材更加难以鉴别因此单纯的依靠传统经验鉴定药材真伪、确定优劣显然是不够可靠。

故本实验利用PCA对复杂信息中的多变量进行快速提取、重新组合、数学降维，生成新的综合变量即主成分，经投影处理后，样本最终落在主成分组成平面上的位置，即可表征不同样本的总体信息通过Logistic进行分析，寻找规律建立数学模型，进而综合评价药材质量。

多变量大数据集无疑会为研究和应用提供丰富的信息，把现代科学和实践经验加以结合，一定能更好地判断药材的优劣，弥补传统经验之不足，保证临床用药安全有效3.2柴胡等级划分与生物活性的关系质量直接影响中医临床疗效，故应以“因效而异”为原则对柴胡质量进行评价。

但对于柴胡活性成分-药效差异的研究相对较少[23-25]目前，药物主要成分与活性相结合的研究已成为评价药物品质的方法之一，故本实验将柴胡成分药效相关联用于柴胡等级评价通过柴胡对COX-2的生物效价研究结果显示，各批次柴胡样品间抗环氧化酶活性差异较大，柴胡质量浓度在。

3.125～25 mg/mL对COX-2抑制作用具有明显的量效关系，建议增加柴胡抗环氧化酶活性作为柴胡质量的区别要点Logistic模型回归对所得预测模型准确性进行了考察，等级归属和各个等级间参数范围明确，结果表明预测能力良好。

本研究首次将柴胡中相关有效成分含量与体外效价相关联，建立柴胡等级分类体系，具有一定应用价值同时也存在一定局限性：样本量少，柴胡样本量仅限于柴胡道地产区陕西境内；为进一步完善柴胡等级研究，后续将扩大样本来源。

3.3药材等级计算器开发本计算器基于JavaScript的web交互跨平台技术，该应用需求也越来越多，JavaScript编辑的交互web页面改变了传统的www访问模式，它把JAVA嵌入在HTML中，无需通用网关接口（

common gateway interface，CGI）即可实现动态交互，既能满足用户对灵活性和方便性的要求，又能对用户提出的要求进行快速响应因此，本计算器针对中药等级评价和“成分-功效”关联计算困难的问题，设计了一种基于。

HTML5的用于中药等级计算的可视化交互系统，能够快速、高效地进行中药等级计算并输出简明的评价结果该计算器可独立使用，也可作为网络插件嵌入大型运算平台使用其特点是将多个中药的生物活性数据和质控成分含量数据作为等级评价依据，采用多元回归分析方法联用。

Logistic回归模型，通过大量数据拟合出特定药材的等级评价方程通过动态地输入测定的数据，可直接经过后台计算最终输出药材的等级评价结果，这样既减少了参数选择的尝试过程，又为准确性提供了保证利益冲突  所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献（略） 来  源：常百金，唐志书，邱智东，刘妍如，宋忠兴，贾艾玲．基于“药效论质”评价柴胡质量及其等级预测插件开发  [J]. 中草药, 2022, 53(2): 424-431 .

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